铁 宁，李 刚，白丽杰，王 静，赵 静，王 勇△

1.内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科，内蒙古呼和浩特 010059；2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特 010059

痛风是一种常见的关节炎，男性发病率高于女性，且各年龄段均可能出现痛风[1]。痛风常在夜间发作，受累关节疼痛进行性加剧，呈撕裂样、刀割样或咬噬样，难以忍受。关节可表现为红肿灼热、皮肤紧绷、触痛明显、功能受限，疼痛感持续几天至几周不等，缓慢减轻至消失[2]。发病关节会导致活动及功能受限，影响日常生活，因此，对痛风的发生、发展机制进行深入研究，并探讨药物治疗的临床疗效和药理作用机制，具有十分重要的意义[3]。有研究指出，在痛风急性发作期患者关节腔内多出现单钠尿酸盐晶体沉积，诱导多形核中性粒细胞聚集，且当炎症反应加重后，产生大量活性氧，诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成，降解趋化因子及细胞因子，抑制炎症反应，有助于急性痛风性关节炎的恢复[4-5]。槲皮素又名栎精，在槐树、苹果、茶树、银杏、西红柿、丹皮等植物中广泛存在，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、祛痰止咳、免疫调节、神经保护及抗血栓等药理作用[6-7]。近年来，有关槲皮素对血清NETs和淋巴细胞水平影响的报道较少。因此，本研究拟构建痛风动物模型，分析槲皮素对痛风动物模型血清NETs和淋巴细胞水平的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究所使用的30只6周龄Wistar雄性大鼠均购自南京青龙山实验动物繁育场，体质量180～210 g，平均(190.32±13.29)g。常规适应性饲养1周，5只1笼，分笼饲养，维持室温22～26 ℃，湿度55%～65%，正常昼夜循环，维持12 h光照，大鼠灌胃、换水、添加饲料等均由专人进行。

1.2方法 将所有大鼠依照体质量编号，并采用随机数表法分为3组，即对照组、模型组、槲皮素组，每组10只。模型组和槲皮素组进行造模，取仰卧位在解剖板上固定，右后肢小腿踝关节进行常规消毒，选取踝关节外侧作为6号注射针穿刺点，针口和胫骨为45°夹角倾向上刺入踝关节腔内，注射250 mg/mL尿酸钠溶液0.2 mL，踝关节对侧鼓起则注射成功。对照组注入等体积的生理盐水。造模成功后槲皮素组大鼠每天早上9：00给予200 mg/kg的槲皮素灌胃，持续给药1周，对照组及模型组同期灌胃等体积的蒸馏水。

1.3观察指标 给药前和第7天给药后依照炎症指数评定准则[8]和Goderre功能障碍指数[9]对大鼠急性炎症状况进行评估，使用足容积测量仪检测足趾肿胀度，炎症指数分级如下：0级，正常；1级，左后足皮肤有红斑、关节稍微肿胀；2级：左后足显著红肿，关节部位骨性标志消失；3级：左后足关节肢体发生肿胀。Goderre功能障碍指数分级如下：0级，步态正常，四足着地均匀；1级，轻微跛行，左后足足趾未展开，着地减轻；2级，跛行显著，左后足趾背着地、屈起；3级：三足步态，左后足完全离地。给药第1天和第6天眼底取血，离心收集血清，使用全自动生化分析仪分析血清中淋巴细胞水平，后取100 μL血清加入100 μL PicoGreen荧光染料，避光孵育300 s，使用荧光染色法检测血清中游离DNA/中性粒细胞胞外诱捕网(cf-DNA/NETs)水平，采用荧光酶标仪检测荧光值，后绘制标准曲线计算cf-DNA/NETs水平。

2 结 果

2.1模型组、槲皮素组大鼠功能障碍指数、炎症指数和足趾肿胀度的比较 本研究结果显示，采用槲皮素干预前模型组和槲皮素组大鼠功能障碍指数、炎症指数和足趾肿胀度差异无统计学意义(P>0.05)；给药后，槲皮素组大鼠功能障碍指数、炎症指数和足趾肿胀度均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 模型组和槲皮素组大鼠功能障碍指数、炎症指数和足趾肿胀度的比较

2.23组大鼠血清中淋巴细胞水平的比较 本研究结果显示，给药前，槲皮素组和模型组大鼠血清中淋巴细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)，但模型组和槲皮素组大鼠血清中淋巴细胞水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步分析发现，给药后3组大鼠血清中淋巴细胞水平差异有统计学意义(P<0.05)，其中模型组最高，对照组最低，且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 3组大鼠血清中淋巴细胞水平检测结果比较

2.33组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比较 本研究结果显示，给药前，槲皮素组和模型组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差异无统计学意义(P>0.05)，但模型组和槲皮素组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步分析发现，给药后3组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差异有统计学意义(P<0.05)，其中模型组最高，对照组最低，且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 3组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比较

3 讨 论

槲皮素分布广泛，属于黄酮醇类化合物，具有多种生物活性。有研究指出，槲皮素具有对抗自由基作用，可捕获自由基预防脂质过氧化反应，抑制肿瘤，并还具有较强的抗炎、抗菌、预防糖尿病、抗过敏等较强的生物活性[10]。此外，槲皮素还具有辅助治疗高血压及冠心病的作用，且槲皮素毒性低，具有较大研究价值。有学者指出，采用槲皮素对痛风性关节炎模型大鼠进行干预后，具有显著的抗氧化、抗炎活性，但其作用机制尚不清楚[11]。有研究指出，将尿酸钠晶体注入大鼠关节腔内可用于建立急性痛风性关节炎病变模型，其临床表现与病理表现相似[12]。采用该方案造模后关节腔内出现中性粒细胞，在滑膜和关节积液中，细胞吞噬尿酸单钠结晶，扩大炎性反应和释放趋化介质，同时关节滑膜肥厚和增生，关节液量增加。该造模方案快速、操作简单、成功率高，被视为经典的急性痛风性关节炎造模方法，因此，本研究采用该方案进行造模。

痛风为慢性且复杂的炎症反应，与机体免疫系统密切相关，其中天然免疫和适应性免疫在机体持续炎症阶段起到十分重要的主导作用。有研究指出，痛风发病初期，天然免疫激活单核细胞进入炎症组织，将尿酸钠晶体吞噬，促进淋巴细胞聚集，合成并分泌大量白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症因子[13]。本研究结果显示，槲皮素干预7 d后，槲皮素组大鼠功能障碍、炎症指数和足趾肿胀度均明显低于模型组，且槲皮素组大鼠体内淋巴细胞水平显著降低。说明槲皮素能够显著减轻痛风模型大鼠的关节腔内炎性反应，减少关节液容积。

人体天然免疫系统中的中性粒细胞是重要的效应细胞，在早期免疫应答阶段起到十分重要的作用。有学者研究发现，中性粒细胞活化后会释放由组蛋白和DNA构成的网状结构，该结构被称为NETs[14]。此外，NETs为球状颗粒串并相互缠绕形成网状陷阱样结构，可限制多种病原微生物扩散，捕获病原微生物，是中性粒细胞杀菌的新途径。但过量NETs可诱导凝血功能障碍、内皮细胞损伤、炎症反应，对机体产生有害作用。本研究结果显示，模型组和槲皮素组大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明显高于对照组，给药后槲皮素组大鼠血清中cf-DNA/NETs明显降低，且槲皮素组大鼠血清中cf-DNA/NETs低于模型组。说明采用槲皮素对痛风模型大鼠干预后可有效降低血中cf-DNA/NETs水平，进而有效下调体内炎症反应程度[15]。

综上所述，槲皮素干预痛风模型大鼠后可有效降低血清NETs和淋巴细胞水平。但本研究并未对基因水平的改变进行分析，有待进一步探讨。