华金骏，李 兴，王 杰△

上海中医药大学附属曙光医院：1.泌尿外科；2.麻醉科，上海 201210

肾癌是泌尿系统常见的肿瘤，在我国发病率呈逐年升高趋势，约25%的患者就诊时已经出现了转移，转移后的患者5年生存率不足10%[1]。虽然手术治疗是肾癌的主要治疗手段，但约有1/2的患者术后出现复发和预后不良，疗效欠佳，占比最高的肾细胞癌对传统放化疗敏感程度也较低，总体而言，目前对于肾癌仍缺乏有效的针对性治疗方法[2]。肾癌组织周围存在大量T细胞、NK细胞、巨噬细胞等，免疫治疗可能成为肾癌治疗的有效手段[3]。肿瘤微环境免疫模式已经被列入肿瘤十大特征之一，既能够预测患者生存预后，还能预测患者放化疗疗效[4]。肿瘤微环境中免疫细胞分布模式与患者生存预后密切相关，免疫细胞浸润模式可以作为治疗依据来提高患者生存率与改善远期预后[5]。目前对肾癌免疫细胞浸润及免疫标志物的研究较少，尚缺乏精准筛选肾癌免疫治疗标志物的方法。常规免疫组化和流式细胞检测技术在评估免疫细胞模式上存在一定的局限，单次评估免疫细胞效率较低。CIBERSORT是目前生物信息学研究中新的基于基因表达大数据去卷积的复杂算法，可以根据患者的基因表达数据转化为免疫细胞浸润比例[6]。本研究采用生物信息学的方法，挖掘肿瘤癌症基因图谱(TCGA)数据库，基于CIBERSORT复杂算法和TCGA肾癌患者样本数据，系统性探讨肾癌患者免疫细胞浸润模式及其与免疫细胞的相关性，深入分析肾癌免疫细胞浸润模式与患者生存预后、临床分期的关系。

1 资料与方法

1.1获取数据 进入在线TCGA网站(https://portal.gdc.cancer.gov/)选择疾病肾癌，数据来源方式选择TCGA，然后选择转录本数据，工作流数据选择矫正过的FPKM数据，下载组织样本基因表达数据[7]，共1 023例，包含正常组织128例，肾癌组织895例。在TCGA网站肾癌中选择临床样本数据，选择TCGA数据来源，选择数据格式bcr xml，方便后期程序化处理，下载关于肾癌的临床数据，包括年龄、性别、生存时间、生存状态、肿瘤分期信息，共943例，运用Excel对临床信息进行筛选，剔除数据缺失、分期状态未知、生存状态未知的患者，保留完整数据的临床信息患者，最终获得526例有效肾癌患者临床特征信息。

1.2评估肾癌免疫细胞浸润 运用Excel对526例肾癌患者临床信息中的年龄、性别、临床分期绘制直观三线表。利用Perl软件(5.26.1)提取肾癌相关转录本中mRNA表达谱数据，生成转录本mRNA的矩阵文件，并进行基因名称转换标准化注释[8]。运用R软件调用CIBERSORT数据包(https://cibersort.stanford.edu/)检查标准化后的矩阵文件中22种肿瘤免疫细胞浸润情况[9]。这22种免疫细胞包括M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、滤泡辅助T细胞等，其中幼稚CD4+T细胞在全部样本中水平为0，故针对性分析其余21种免疫细胞。运用Perl数据包，以P<0.05为差异有统计学意义，最终筛选得到10例正常组织和558例肾癌组织免疫细胞浸润信息。运用Excel分别绘制正常和肾癌组织免疫细胞占比饼图。运用R软件包中vioplot 包绘制可视化肾癌组织与正常组织免疫细胞构成比小提琴图，利用R软件包中的corroplot包分析免疫细胞间的相关性。将免疫细胞水平矩阵与其对应的TCGA临床数据合并，生成包含临床数据和免疫细胞浸润信息的TXT文本，运用R软件包中的survival包完成生存分析，以及免疫细胞浸润与肾癌临床分期相关性评价。

1.3统计学处理 总生存期定义为从诊断日期开始到死亡日期之间的间隔，应用R软件包批量绘制K-M生存分析曲线，并进行假设检验(Log-Rank test)分析差异。肾癌分期中两组样本的比较采用Wilcoxon秩和检验，两组以上样本的比较则采用Kruskal-Wallis秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义[10]。

2 结 果

2.1肾癌患者临床特征 从TCGA下载肾癌临床相关数据，剔除不完整的数据，得到526例肾癌患者临床信息，包含年龄、性别、临床分期信息，见表1。

表1 肾癌患者临床病理特征

2.2肾癌免疫细胞浸润分布 从TCGA下载到1 023例免疫细胞浸润信息，经过筛选后获得10例正常组织，558例肾癌组织免疫细胞浸润信息，绘制正常组织和肾癌组织免疫细胞构成比图及肾癌免疫细胞相关性热图。结果显示，肾癌组织与正常组织相比，M2巨噬细胞水平较高(P<0.05)；幼稚B细胞、浆细胞、未活化的CD4+记忆T细胞、静息态树突状细胞水平较低(P<0.05)。同时，在肾癌组织中，CD8+T细胞与滤泡辅助性T细胞(r=0.59)、γδT细胞水平呈正相关(r=0.60)；CD8+T细胞与M2巨噬细胞水平(r=-0.55)、未活化的CD4+记忆T细胞水平(r=-0.62)呈负相关。

2.3肾癌浸润性免疫细胞水平与临床相关性评价

2.3.1与临床分期的相关性 将获得的临床分期信息与其对应的免疫细胞浸润信息进行合并，绘制肾癌浸润性免疫细胞与临床分期箱式图，见图1。随着临床分期的进展，未活化的NK细胞、单核细胞、未活化的肥大细胞、未活化的CD4+记忆T细胞水平逐渐降低，提示这些细胞抑制肾癌进展；M0巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞、CD8+T细胞、活化的CD4+记忆T细胞、浆细胞、调节性T细胞水平随着肾癌进展逐渐递增，提示这些细胞促进肾癌进展。

图1 肾癌浸润性免疫细胞水平与临床分期箱式图

2.3.2与生存预后的相关性 根据肾癌免疫细胞构成比高和低，结合假设检验(Log-Rank test)计算其与生存的相关性，批量绘制肾癌组织免疫细胞K-M生存曲线，见图2。可以发现，低水平调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞的患者5年生存率更高；高水平单核细胞、静息态树突状细胞、未活化的肥大细胞的患者5年生存率更高。

注：A、B、C、D、E分别代表低水平和高水平调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞、单核细胞、静息态树突状细胞、未活化的肥大细胞患者生存率的比较。

3 讨 论

目前，相关学者对肿瘤免疫细胞浸润的研究和认识逐步提升，发现某些特定的免疫细胞亚群在预测个体化特异性治疗效果上起着主要作用[11]。通常实验室采用流式细胞术和免疫组化技术分析肿瘤免疫细胞，但流程相对较复杂，周期较长。CIBERSORT是斯坦福大学研究人员写出的分析包，创新性采用反卷积算法，可以准确、快速地分析基因表达数据，目前得到广泛应用[12]。本研究基于TCGA数据库分析肾癌患者免疫细胞浸润和临床相关信息，对肾癌免疫细胞浸润模式进行了分析评价，发现对比正常组织，肾癌组织M2巨噬细胞水平较高；幼稚B细胞、浆细胞、未活化的CD4+记忆T细胞、静息态树突状细胞水平较低。已有研究表明，M2巨噬细胞与肿瘤增殖、侵袭、转移密切相关[13]，高水平的M2巨噬细胞是肾乳头状癌的核心特征之一，高水平的静息态树突状细胞与透明肾细胞癌的预后呈正相关[14]。在肾癌组织中，CD8+T细胞与滤泡辅助性T细胞、γδT细胞水平呈正相关(P<0.05)；CD8+T细胞与M2巨噬细胞、未活化的CD4+记忆T细胞水平呈负相关(P<0.05)，说明CD8+T细胞改变与肾癌免疫微环境的变化密切相关，针对243例肾透明细胞癌患者的队列研究也证实CD8+T细胞对诱导肿瘤免疫和细胞分布具有重要意义[15]，这提示CD8+T细胞可能在免疫微环境平衡调控中发挥重要作用。

通过将肾癌免疫细胞浸润模式与临床分期特征结合分析，发现随着肾癌进展，未活化的NK细胞、单核细胞、未活化的肥大细胞、未活化的CD4+记忆T细胞水平逐渐降低；M0巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞、CD8+T细胞、活化的CD4+记忆T细胞、浆细胞、调节性T细胞水平逐渐增加，提示免疫细胞浸润模式的改变与肾癌的进展密切相关。有研究表明，相对于肾透明细胞癌低危患者，高危患者的滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞、M0巨噬细胞水平明显升高[16]。M0巨噬细胞主要作用是吞噬清除凋亡细胞及致病物质，能够调控免疫应答，促进组织重构、纤维化等[17-18]。单核细胞可以通过吞噬和产生抗体消灭外来入侵病原体，随着肿瘤进展，机体防御系统功能下降，失去对肿瘤的控制。当效应T细胞初次与肿瘤作用后，肿瘤抗原得到清除，T细胞逐步凋亡，但其中有少量的效应T细胞转为记忆T细胞，长期存活发挥效应，在遭遇同种抗原攻击时，快速介导发生效应。伴随肿瘤的进展，T细胞逐步变为效应T细胞，发挥肿瘤抗原清除作用，活化的CD4+记忆T细胞增多。调节性T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞、外周淋巴细胞和局部淋巴结中占比较高，与包括肾癌在内的多种肿瘤进展密切相关，可以增强肿瘤抗原识别，加速抗原清除[19]。这些免疫细胞可能参与了肾癌的发生和进展，为肾癌的诊断和转归提供了参考。

通过结合肾癌患者生存状态进一步分析，发现低水平调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞的肾癌患者5年生存率更高，高水平单核细胞、静息态树突状细胞、未活化的肥大细胞的肾癌患者5年生存率更高。调节性T细胞在维持免疫稳态，介导外周信号上发挥重要作用，临床研究表明，外周血调节性T细胞的高水平与肾细胞癌患者的不良生存预后密切相关[20]。滤泡辅助性T细胞是近些年来发现的一群独立的CD4+T细胞亚群，但目前有关肾癌中滤泡辅助性T细胞的研究较少，仍有待进一步探索[19,21-22]。树突状细胞是最强的专职抗原提呈细胞，是CD4+和CD8+T初始细胞的主要激活细胞，然而肿瘤微环境中的因素会减弱树突状细胞的抗原提呈功能，从而限制T细胞活性，促进肿瘤生长[23]。静息态树突状细胞水平与肾癌5年生存率相关，对比发现，其在正常组织中水平较高，在肾癌组织中水平较低，但是正常组织和肿瘤组织中活化的树突状细胞水平均不高，可能是肾癌肿瘤微环境抑制了树突状细胞的功能，减少抗原提呈，发生了免疫逃逸。已有学者研究表明，肥大细胞能够加速肾癌细胞侵袭和迁徙，促进肾癌恶化[24]。

目前有关肾癌组织免疫细胞浸润模式的研究较少，本文通过CIBERSORT算法结合生物信息学对肾癌免疫细胞浸润模式进行了系统性分析，肾癌患者发病年龄整体较高，发病相对隐匿，如何早期鉴别肾癌、及时预测肾癌转归是今后重要的研究方向。相对正常组织，肾癌组织免疫细胞构成明显不同，M2巨噬细胞明显增多，同时伴随肿瘤的恶化，肾癌免疫细胞浸润模式逐步改变，单核细胞、NK细胞、树突状细胞等免疫细胞的抗原清除能力逐步降低，肿瘤微环境的免疫抑制逐步提升。临床上可以将肾癌免疫细胞浸润模式作为参照，预测肾癌患者的生存期及肿瘤进展情况，开展肾癌的个体化免疫治疗，改善患者预后，提高患者生存率，使更多患者获益。