施芬，罗汉清(武汉市中心医院新洲院区&武汉市新洲区人民医院儿科，武汉 430400)

儿童哮喘诊断和病情严重程度的判断主要依据临床症状和肺功能，在诊断和治疗上缺乏特异性标志物。炎症和免疫反应、细胞和细胞外基质间的相互作用与支气管哮喘进展关系密切，检测相关标志物不仅辅助哮喘的诊断，而且可深入探讨哮喘发作时的炎症细胞和细胞因子的调控机制[1]。白三烯D4(LTD4)和干扰素γ(IFN-γ)是临床上对哮喘发作及严重程度评估常用的诊断标志物[2]，但二者的特异性及敏感性不高。寻找更特异的儿童哮喘诊断标志物对提高儿童哮喘诊治水平具有重要的意义。微纤维相关蛋白4(microfibrillar-associated protein 4, MFAP4)是一种属于纤维蛋白原相关蛋白超家族的细胞外基质蛋白，在先天免疫和内皮细胞功能的发挥过程中起重要的作用[3]。研究显示，MFAP4可调节支气管平滑肌细胞增殖并促进气道嗜酸性粒细胞增多，气道高反应性和肺重塑并促进过敏性哮喘的发生[4]。可溶性微纤维相关蛋白4(soluble microfibrillar-associated protein 4, sMFAP4)是一种分泌蛋白质，以可溶性形式存在于外周循环中[5]。本研究通过检测哮喘患儿和健康儿童中sMFAP4、LTD4和IFN-γ的表达水平，旨在分析其对儿童哮喘筛查及病情评估的价值。

1 材料和方法

1.1一般资料 纳入武汉市新洲区人民医院儿科2019年1月至12月收治的哮喘患儿100例为哮喘组，其中包括哮喘发作期患儿50例，其中男30例，女20例，年龄(8.9±2.7)岁。诊断均依据中华医学会儿科学分会呼吸学组修订《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》标准诊断[6]。儿童哮喘严重程度标准依据“全球哮喘防治创议”(GINA方案)进行[7]。50例急性发作期患儿中，哮喘轻度发作21例，中度发作24例，重度发作5例，以及哮喘缓解期患儿50例。纳入标准:(1)年龄4～12岁；(2)首次哮喘发作；(3)支气管哮喘发作诊断明确，患儿存在急性发作期和临床缓解期的临床资料；(4)入选儿童在72 h内未使用糖皮质激素、β2受体激动剂、抗胆碱能类、抗组胺、白三烯拮抗剂及茶碱类药物。排除标准：(1)不符合上述纳入标准；(2)患者临床资料和随访资料不全的患者；(3)患者家属拒绝参与研究者。选择同期年龄和性别相匹配的体检健康儿童50例为健康人对照组，其中男29例，女21例，年龄(8.8±2.3)岁。哮喘组患儿与健康人对照组儿童年龄和性别比较，差异无统计学意义(χ2分别为14.36,18.36，P均>0.05)。所有患儿发作后均收入院经规则联合吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroids，ICS)/长效β2受体激动剂(long-acting beta2 agonists，LABA)治疗后哮喘缓解。本研究经武汉市新洲区人民医院医学伦理委员会批准(No.WHXZ-P-20190112),各研究对象均签署知情同意书。

1.2主要仪器及试剂 sMFAP4、白三烯D4(LTD4)和干扰素γ(IFN-γ)酶联免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份公司)，Stat Fax-2100型酶联仪(美国Awareness公司)，TGL-16M台式高速离心机(济南博科公司)，乙二胺四乙酸二钾抗凝管(沈阳宝康生物公司)。

1.3方法

1.3.1血液样本收集 于哮喘患儿急性发病入院时，临床缓解期于随访期间，采集患儿空腹静脉血样本，健康人对照组儿童在体检当日清晨采集外周血 5 mL，4 ℃、1 500×g离心10 min，取上清液，采用乙二胺四乙酸二钾抗凝管收集，置于-80 ℃冻存待测。

1.3.2ELISA法测定血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ浓度 按照人sMFAP4、LTD4和IFN-γ ELISA试剂盒说明书检测哮喘组和健康人对照组血清中sMFAP4、LTD4和IFN-γ浓度。采用Stat Fax-2100型酶联仪在450 nm波长处依次测量各孔的吸光度(A450 nm值),并计算sMFAP4、LTD4和IFN-γ浓度。参考范围：LTD4：2～10 ng/mL，sMFAP4：1～2 ng/mL，IFN-γ：70～120 ng/mL。

2 结果

2.1各组血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ浓度比较 哮喘患儿急性发作期血清sMFAP4浓度及LTD4浓度显著高于健康人对照组和哮喘缓解期患儿(P<0.05)，但哮喘患儿急性发作期血清IFN-γ 浓度显著低于健康人对照组和缓解期患儿(P=0.001)。见表1。

表1 各组血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ浓度比较(ng/mL)

2.2各指标对儿童哮喘的筛查效能比较 以儿童哮喘诊断标准为金标准，选取哮喘患儿为实验组，健康儿童为对照组，将实验组和对照组sMFAP4、IFN-γ、LTD4浓度纳入ROC曲线分析，评估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及联合检测筛查儿童哮喘的效能。ROC曲线分析结果表明，血清sMFAP4浓度筛查儿童哮喘症的ROC曲线下面积(area undercurve，AUCROC)显著高于IFN-γ及LTD4，而联合检测sMFAP4、IFN-γ、LTD4筛查儿童哮喘症的AUCROC亦显著高于单项指标。见表2、图1。

表2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4对儿童哮喘症的筛查价值比较

图1 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4对儿童哮喘症筛查价值的ROC曲线

2.3各指标区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的效能比较 以儿童哮喘急性发作期诊断标准为金标准，选取哮喘急性发作期儿童为实验组，以哮喘临床缓解期患儿为对照组，将实验组和对照组sMFAP4、IFN-γ、LTD4浓度纳入ROC曲线分析，评估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及联合检测区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的效能。血清sMFAP4区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUCROC高于IFN-γ、LTD4，联合检测sMFAP4、IFN-γ、LTD4区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUCROC高于单项指标。见表3、图2。

表3 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4筛查儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的效能比较

图2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的ROC曲线

3 讨论

哮喘发作和严重程度常用的临床诊断标志物包括LTD4和IFN-γ等[2]。LTD4是哮喘发病过程中的炎症介质，在哮喘发病中促进炎性反应细胞聚集，并促进气道高反应性。本研究结果发现，哮喘急性发作期患儿LTD4浓度高于哮喘缓解期患儿及健康人对照组，这与刘芳君等[8]研究结果相一致。

在哮喘发病过程中，T细胞激活和细胞免疫发挥关键作用，TH1/TH2细胞平衡紊乱是哮喘发病机制之一[9]。哮喘发作时，TH2型细胞因子过度分泌，TH1细胞分化减少，继而由TH1细胞分泌的IFN-γ浓度显著降低，故而IFN-γ浓度在哮喘患者中下降明显[10]。本研究亦发现哮喘急性发作期IFN-γ浓度显著低于哮喘缓解期及健康人对照组。

MFAP4是种细胞外基质蛋白，属于纤维蛋白原相关蛋白超家族，在富含弹性蛋白的组织(如心脏和肺)中呈高表达[3,11-12]，MFAP4基因定位于12q15上，以膜蛋白和可溶性(sMFAP4)形式存在于机体[12]。另有研究发现，急性心肌梗死患者循环中sMFAP4显著增加[5]；且MFAP4是肝脏和肺纤维化的潜在标志物[13]。sMFAP4在支气管哮喘发病及进展中扮演着重要的角色。sMFAP4可促进支气管平滑肌细胞增殖及嗜酸性粒细胞趋化因子分泌，进而促进气道嗜酸性粒细胞增多、气道高反应性及肺重构，诱导过敏性哮喘的发生[13]。Pilecki等[14]发现，在卵清蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘动物模型中，sMFAP4在支气管平滑肌细胞中表达增加，并与α1β3整合素受体结合，促进支气管平滑肌细胞增殖和迁移。Johansson等[15]报道慢性阻塞性肺病患者血清sMFAP4浓度与慢阻肺病情严重程度及急性发作呈正相关。本研究发现，哮喘患儿血清中sMFAP4浓度高于健康人对照组，同时哮喘急性发作期水平高于临床缓解期，提示MFAP4参与哮喘发病过程，其表达变化可通过检测外周循环中sMFAP4变化水平而反映出来。本研究结果与文献[16]报道基本一致，其研究证实在成人哮喘患者中，轻度和重度哮喘患者血清sMFAP4浓度高于健康对照者，其表达水平改变与患者是否接受β2受体激动剂治疗无关。

血清中sMFAP4浓度具有良好的筛查儿童哮喘及区分急性发作期和临床缓解期的临床效能，血清sMFAP4浓度筛查儿童哮喘及区分急性发作期和临床缓解期的AUCROC、敏感性及特异性均高于LTD4 和IFN-γ，显示出良好的临床筛查及评估病情严重程度的效能，有望成为儿童哮喘无创辅助诊断及病情判断标志物。笔者进一步分析发现，sMFAP4、LTD4 和IFN-γ 三者联合应用筛查儿童哮喘及区分急性发作期和临床缓解期的AUCROC、敏感性及特异性均高于单项指标检测，提示联合检测上述标志物可提高儿童哮喘的筛查及对儿童哮喘病情评估价值。本研究亦存在一定的不足之处，如未能分析sMFAP4与不同程度哮喘的急性发作存在何种程度的关系，以及未进一步明确sMFAP4与呼吸功能、白细胞及IgE的关系如何，值得进一步研究。