祁大庆，陈琳慧，万林春

（1.杭州胡庆余堂药业有限公司，浙江 杭州 310000；2.江西省药品检验检测研究院，江西 南昌 330029）

胃癌（gastric cancer）的临床发病率及死亡率在各类肿瘤中位于前列[1]。虽然胃癌的发病率在过去20年中有所下降，但它仍然是世界上最常见的癌症之一[2-4]。在胃癌中最常见的类型是腺癌，其它类型的胃癌相对罕见[5]。胃癌的传统治疗方法为外科手术结合术后局部或全身放疗，具有一定的疗效。但无论是手术技术和方法的改进还是放疗设备和技术的进步，都没有显著改善胃癌患者的5年生存率。在临床实践中，胃癌的药物治疗主要用于无法手术或晚期患者的姑息治疗。现有的化疗药物例如5-氟尿嘧啶、顺铂等治疗胃癌的临床疗效并不理想[6]。因此，从中成药组成中寻找抗癌活性物质现在研究领域的科研热点[7-9]。

胃复春胶囊由红参、香茶菜、枳壳（炒）配伍而成，具有健脾益气、活血解毒的功效。可用于治疗胃癌癌前期病变，胃癌手术后辅助治疗、慢性浅表性胃炎属脾胃虚弱证者[10]。胃复春对抑制肿瘤细胞的生长有很多报道，但胃癌的作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨胃复春胶囊提取物对胃癌MGC-803细胞活性、凋亡及凋亡相关的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）和Bcl-2家族蛋白表达量的影响，为揭示胃复春胶囊的抗癌活性、作用机理及临床应用前景提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 胃复春胶囊提取物（国药准字Z20090697）购买自杭州胡庆余堂有限公司；人胃癌细胞系MGC-803细胞购于中国科学院上海细胞库；青霉素、链霉素、胎牛血清购于美国Invitrogen公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购于赛信通（上海）生物试剂有限公司；Hoechst 33258核酸染料购自北京雷根生物技术有限公司；AnnexinV-FITC/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒，细胞培养液RPMI1640，细胞浆蛋白抽提试剂盒均购于上海元龙生物技术有限公司；Bcl-2、Bax、Casepase-3、Casepase-9、β-actin 等抗体均购于上海哈灵生物科技有限公司；DSMO及其它分析纯化学试剂购于北京试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MGC-803细胞培养于湿度饱和，含青霉素（100 U·mL-1）、链霉素（100 μg·mL-1）、10%胎牛血清的PMI1640培养液中。细胞培养箱条件：37℃，含5% CO2。实验选取对数生长期细胞。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 选取浓度为1×105mL-1的MGC-803细胞，以200 μL/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，每孔分别加入终浓度为0、25、50、100 μg·mL-1的胃复春胶囊提取物（样品事先溶解于DMSO）。每一浓度均设置5个复孔，以终浓度为0作为空白对照，分别继续培养24 h后，吸去药液，每孔加入含10%的CCK-8的培养基100 μL，继续孵化4 h，用分光光度计在450 nm下测定各孔吸光度值（A）。

1.2.3 Hoechst 33258染色细胞凋亡检测实验 取浓度为 1×105mL-1的 MGC-803 细胞，以 200 μL/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，每孔分别加入终浓度为0、25、50、100 μg·mL-1的胃复春胶囊提取物，继续培养细胞24 h后，以冷的PBS清洗细胞1次，加入4%多聚甲醛，在室温下固定15 min，再以冷的PBS清洗2 次，室温下加入 1 mmol·L-1Hoechst 33258，染色15 min，封片，在340 nm激发光下使用荧光显微进行观察。

1.2.4 细胞凋亡及细胞周期检测 根据制造商的说明，使用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测早期和晚期细胞凋亡。MGC-803细胞以4×105mL-1浓度接种于12孔板，待细胞贴壁后，每孔分别加入终浓度分别为 0、25、50、100 μg·mL-1的胃复春胶囊提取物培养24 h，然后用冰冷的PBS洗涤细胞2次，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，收集细胞并用PBS洗涤。将细胞重新悬浮在400 μL Annexin结合缓冲液中，然后在室温下与 AnnexinV-FITC（5 μL）和 PI（10 μL）孵育 5 min。用流式细胞仪（BD Biosciences）检测MGC-803细胞的凋亡。另取每孔细胞用冷的PBS洗涤2次，4℃下70%乙醇预冷固定24 h，PBS洗涤2次，加入PI染色液，暗染30 min，流式细胞仪分析细胞周期。

1.2.5 细胞凋亡相关蛋白表达量检测 取1×106mL-1浓度的MGC-803细胞，接种于6孔培养板内，待细胞贴壁后，每孔分别加入胃复春胶囊提取物，使终浓度达到 0、25、50、100 μg·mL-1，处理 24 h 后，收集细胞，根据试剂盒说明书的方法，提取细胞质中的总蛋白并测定其浓度。以肌动蛋白（β-actin）为内标做 Western blot分析，检测 Bcl-2、Bax、Casepase-3 和Casepase-9的表达。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS21.0软件进行统计分析，计量数据用平均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃复春胶囊提取物对MGC-803细胞增殖的抑制作用 胃复春胶囊提取物分不同浓度进行处理24 h后，用CCK-8法测定细胞活力。如图1所示，在浓度 30～100 μg·mL-1范围内胃复春胶囊提取物对MGC-803细胞活力都能体现出显著且呈剂量依赖性地抑制效应。

2.2 胃复春胶囊提取物可诱导MGC-803细胞产生凋亡 作为一种细胞通透性核复染色剂，Hoechst33258核酸染料与dsDNA结合后能被活细胞吸收并激发蓝色荧光。胃复春胶囊提取物处理组MGC-803细胞核浓缩、碎裂，有较强的蓝色荧光（如图2所示）。

流式细胞仪双染色结果表明，胃复春胶囊提取物能诱导MGC-803细胞产生凋亡。如图3所示，25、50、100 μg·mL-1的 胃 复 春胶囊 提 取 物 处 理MGC-803细胞24 h后，细胞凋亡率分别为（20.4±2.7）%、（41.3±6.2）%、（68.8±5.8）%，明显高于对照组凋亡率（3.8±1.6）%（P＜0.05），且其作用具有明显剂量依赖性。

图3 胃复春胶囊提取物可诱导MGC-803细胞凋亡（流式细胞术Annexin V-FITC和PI双染色实验）

2.3 胃复春胶囊提取物可阻滞MGC-803细胞周期不同浓度胃复春胶囊提取物（25、50、100 μg·mL-1）处理MGC-803细胞24 h后，G0/G1期细胞比例增加，而G2/M期与S期细胞比例减少。其中，100 μg·mL-1胃复春胶囊提取物处理组中，G0/G1期细胞比例由48.51%大幅度增至77.08%（P＜0.01），而S期细胞比例由37.03%降低至19.39%（P＜0.01），G2/M期细胞比例由14.46%降低至3.53%（P＜0.01）。结果说明胃复春胶囊提取物使MGC-803细胞周期阻滞在G0/G1期，正常的细胞增殖周期被抑制。

不同浓度胃复春胶囊提取物（25、50、100 μg·mL-1）处理24 h后，MGC-803细胞周期分布如表1所示。

表1 胃复春胶囊提取物处理后MGC-803细胞周期的变化

2.4 胃复春胶囊提取物对MGC-803细胞Bcl-2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、Bax 表达量的影响 如图4A所示，未用胃复春胶囊提取物处理的MGC-803细胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表达量较低。而经过胃复春胶囊提取物（浓度分别为 25、50、100 μg·mL-1） 处理 24 h 后，MGC-803细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表达量显著增加。此外，胃复春胶囊提取物可以浓度依赖地上调促凋亡蛋白Bax的表达量，且浓度依赖地下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量（β-actin作为内参）。因此胃复春胶囊提取物处理后的细胞中Bcl-2/Bax的比例显著降低。利用Image J软件对Western Blot条带进行灰度分析和柱状图构建，蛋白表达量变化如图4B 所示，*P＜0.05，**P＜0.01。

图4 胃复春胶囊提取物对MGC-803细胞中Bax，Bcl-2，cleaved Caspase-3，cleaved Caspase-9表达量的影响

3 讨论

包括民族医药学在内的中医药是防治癌症的有力武器。对比化学药物，中药往往具有原料方便易得、价格低廉、毒副作用小等优点[11-12]。在临床实践中，中药对于癌症患者在减轻症状、预防复发或转移、提升生活质量、延长生存时间、降低放化疗不良反应风险等方面具有优势。近年来，学术界对于单味药和复方中成药的抗癌活性研究逐渐成为成为研究的焦点[13-15]。胃复春胶囊临床主要适应证为脾胃虚弱、胃癌、慢性浅表性胃炎、胃炎等，具有较为广泛的药理活性。药理学研究表明胃复春具有抗肿瘤、抑制幽门螺旋菌、抗胃黏膜上皮化生（肠化），升高环磷腺苷等作用。然而，胃复春胶囊提取物的体外抗肿瘤活性研究还不够深入，对肿瘤细胞作用的具体机理尚不清楚，本文重点研究了胃复春胶囊提取物对胃癌细胞活力和凋亡的影响。

Hoechst33258是一种能穿透细胞膜对DNA进行染色的核染色试剂，插入双链DNA后发出强烈的蓝色荧光。由于Hoechst 33258是一种具有膜通透性的荧光染料，正常细胞和早期凋亡细胞均可被Hoechst 33258染色，但正常细胞核呈圆形，浅蓝色，或深蓝色颗粒；凋亡细胞核因浓缩而呈亮蓝色，或细胞核分叶状、碎裂、边缘化。结果表明，胃复春胶囊提取物能显著增强MGC-803细胞的蓝色荧光，提示胃复春胶囊提取物能增加细胞膜通透性，诱导MGC-803细胞产生凋亡[16-17]。

人体自我调节机制之一是体内多细胞生物维持内部环境稳定，细胞凋亡是肿瘤治疗的热点，也是评价抗癌药物疗效的重要指标之一[18-20]。此次研究发现，胃复春胶囊提取物在 0～100 μg·mL-1浓度范围内对人胃癌MGC-803细胞增殖有抑制作用，24 h后胃复春胶囊提取物可剂量依赖地诱导MGC-803细胞凋亡。

Caspase家族蛋白是一类存在于细胞质中的结构相关的半胱氨酸蛋白酶。它们的一个重要相似之处是活性位点含有半胱氨酸，可断开天冬氨酸残基肽键[21]。Caspase家族蛋白与细胞凋亡形态学特征变化（如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等）以及一些生化改变关系密切，这类蛋白的激活被认为是细胞凋亡的直接效应器。在本次研究中，发现胃复春胶囊提取物可以浓度依赖性的方式增加MGC-803细胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表达。cleaved Caspase-9主要参与细胞凋亡的起始，cleaved Caspase-3可参与细胞凋亡的执行，它们可通过降解PARP，导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解[22]。因此本实验结果提示胃复春胶囊提取物可能是通过增强细胞内Caspase活性抑制细胞增殖，并进而达到促进了细胞凋亡的目的。

Bcl-2是一种特殊的蛋白组群，Bcl-2组群中bad、bid、Bax 等可以促进细胞凋亡，Bcl-2 组群中Bcl-2、Bcl-w可以阻止细胞凋亡。Bcl-2是一种内膜蛋白主要存在于线粒体、内质网和核膜中，在多种肿瘤细胞中均有高表达，它可以阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，提高线粒体膜电位，进而抑制钙释放，阻止核酸内切酶激活，从而起到抗凋亡作用；与Bcl-2不同，Bax能直接激活Caspase或改变细胞膜通透性，使细胞色素C通过细胞膜释放一些离子和小分子，从而促进细胞凋亡。Bcl-2与Bax的比值大小能够影响细胞凋亡。当Bcl-2占多数时，细胞具有抗凋亡作用；相反，当Bax过度表达时，细胞往往容易发生凋亡[23-25]。本研究发现胃复春胶囊提取物作用24 h后，Bcl-2表达下调，Bax表达上调，Bcl-2/Bax比值升高，与胃复春胶囊提取物的凋亡作用呈正相关。提示胃复春胶囊提取物通过调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡。由于胃复春胶囊提取物不是单一靶点起作用，具有多靶点性。因此，进一步研究胃复春胶囊提取物诱导MGC-803细胞凋亡的机制、阻断细胞传导通路和信使的相关研究对其临床应用具备很好的指导意义。

综上所述，胃复春胶囊提取物能抑制MGC-803细胞增殖，并呈剂量依赖性诱导细胞凋亡。其作用机制可能是通过上调Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，增加Caspase-9的活性、增加Caspase-3的活性，从而促使胃癌细胞的凋亡。本研究为中医药治疗胃癌提供了新的思路。