崔喜喜，韩宗昌，李记天，李无阴，张 虹，△

（1．河南中医药大学，河南 郑州 450046；2．河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 洛阳 471002）

骨髓炎（osteomyelitis）是临床上常见的感染性疾病，多发生于四肢长管状骨，急性期治疗不及时易发展为慢性骨髓炎，严重者可致畸致残，影响患者生活质量[1-2]。无论是急性骨髓炎还是慢性骨髓炎，在临床上均以抗生素治疗为主[3-4]，慢性骨髓炎长期反复应用抗生素容易使细菌产生耐药性，这对临床治疗产生不良影响[5]，因此亟需寻找一种新型治疗方法或研发一种靶向药物来治疗骨髓炎。大量临床数据显示中医药治疗骨病疗效显著，且能够避免耐药性[6-8]，因此有必要深入探索中医药治疗骨髓炎的有效方法及药物作用机制。

中医古籍对骨髓炎有着明确的记载，多数医家将其归为“附骨疽”“骨蚀”[9]，《黄帝内经》描述：“虚邪之入于身也深……，内伤骨为骨蚀”。中医学根据发病症状总结为早期邪毒壅盛，气血阻滞，辨证属热毒炽盛；中期毒热内盛，气血耗损，辨证属正虚邪滞；后期热毒伤阴，正气虚损，辨证属气阴两虚。纵观整个发病过程，多存在“毒、虚”的临床特点，因此有医家将“益气解毒”作为治疗骨髓炎的核心原则。

刘艳等[7]总结不同医家治疗骨髓炎的用药规律，分析了100条方剂，涉及162味中药，发现金银花、黄芪为高频中药。金银花味甘，性寒，归肺、心、胃经[10-11]，具有清热解毒的功效，现代药理学发现其含有绿原酸类化合物[12]、黄酮类化合物[13]等活性成分，并证实其广谱抗菌、抗病毒、增强免疫的功效[10-13]。黄芪味甘，性微温，归脾、肺经，具有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌的功效，被誉为补气之圣药[14]。金银花配伍黄芪能清热解毒兼以补益气血，符合中药治疗骨髓炎的用药特点[7，15]。

网络药理学是通过大数据预测药物多成分、多靶点、多途径治疗疾病的可能机制，分子对接技术是通过受体与药物分子之间的相互作用，从分子水平上模拟验证中药有效成分作用于疾病的科学依据。基于此，本研究利用网络药理学预测金银花-黄芪药对治疗骨髓炎可能的作用机制，并采用分子对接技术进行验证，为临床用药提供理论支持，同时为新药的研发提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的筛选 在TCMSP数据库中检索“金银花”“黄芪”获得其活性成分信息，并设置口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18进行筛选。

1.2 药物作用靶点预测与疾病靶点查询 在TCMSP数据库中进行检索，获取化合物的靶点，并在 Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）中对各靶点人类基因简称进行查询转化，获取相关基因。在 GeneCards数据库（https：//auth.lifemapsc.com）中以“osteomyelitis”为检索词进行检索，获取骨髓炎已知的相关靶基因。

1.3 共同靶点的确定 在网站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中导入药物作用靶点和疾病作用靶点的相关基因数据，绘制Venny图获取药物（金银花和黄芪）靶点与疾病（骨髓炎）靶点的交集为共同靶点，即为金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的潜在靶点。

1.4 成分-靶点网络构建 将确定的药物成分、疾病共同靶点导入Cytoscape3.8.2（美国）构建“成分-靶点”网络图。在获取的结果图中，各个节点代表着可能存在的化合物和靶蛋白，线条代表着化合物和靶蛋白的相互作用。使用Cytoscape3.8.2中网络分析（Network analyzer）功能，对 Degree、Betweenness Centrality（BC）和 Closeness Centrality（CC）进行分析，以获取金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的主要活性成分。

1.5 蛋白相互网络的构建 将药物和疾病的靶点导入在线系统Bisogenet进行扩展，然后取交集初步获得金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的直接和间接靶点，设置上述获得靶点Degree的2倍中位数为标准进行筛选，然后运用网络拓扑分析软件CytoNCA进行分析，根据Degree、BC、CC等参数进行进一步筛选，以准确的深度挖掘金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的直接或间接作用靶点，构建蛋白质相互作用（PPI）网络。

1.6 生物通路的分析 在Metascape数据库中将金银花-黄芪药对的作用靶标进行基因本体论（GO）分析与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到通路富集结果，将相关筛选标准设置为P＜0.01。

1.7 分子对接 利用AutoDock及Pymol软件将金银花-黄芪药对中的主要活性成分与靶蛋白进行分子对接并可视化，计算关键活性成分及关键靶点的分子结合能，并以结合能≤-5.0 kJ/mol为判定标准，验证金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的科学性。

2 结果

2.1 药物的活性成分及相应靶蛋白 在TCMSP数据库中共检索出236种金银花活性成分、87种黄芪活性成分，筛选后得到符合标准的金银花活性成分23种，黄芪活性成分20种，如黄酮类、环烯醚萜类和生物碱类化合物，这些化合物很有可能就是金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的主要活性成分群。详见表1、表2。

表1 金银花生物活性成分

表2 黄芪生物活性成分

2.2 药物靶点预测及共同靶点的确定 在Uniprot数据库中输入潜在靶点的PDB ID，并剔除重复的基因靶点。在GeneCards数据库（https：//auth.lifemapsc.com）中以“Osteomyelitis”为检索词进行检索，获取已知的疾病靶点953个。取两者交集的共同靶点共21个，这些为金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的可能靶基因，并绘制Venny图。详见表3、图1。

表3 药物治疗疾病的潜在靶标

图1 共同靶点

2.3 成分-靶点与疾病靶点网络 以预测的21个基因作为金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的靶点，使用Cytoscape3.8.2建立金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的网络图，见图2。排名前5的关键成分分别为quercetin、kaempferol、ursolic acid、apigenin、luteolin，这些成分对治疗骨髓炎有重要的作用。详见表4。

图2 药物治疗骨髓炎的成分-靶点网络图

表4 主要活性成分拓扑参数

2.4 蛋白质相互作用网络构建 利用Bisogenet进行扩展，CytoNCA进行分析，构建PPI网络，见图3。设置 Degree为 12、BC 为 0.013907、CC 为 0.53、LAC为 28.025、Neighborhood Conne（NC）为 13.3125 为筛选条件进行筛选并取交集为核心蛋白，见图4。结果显示排名前 3的是 HSPA5、MAP3K14、DHX9，表明这些蛋白在网络中起到关键作用，可能是金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的关键靶点。

图3 药物治疗骨髓炎PPI图

图4 蛋白互作网络图中的核心蛋白

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析 将21个药物与疾病的共同靶点映射到Metascape数据库中，筛选背景选择为“Human”进行生物学功能富集，富集条件设置为 P Value Cutoff=0.01、Min Enrichmen=1.5，系统的分析其生物过程并选择排名前5的进行图例展示。GO富集中交集基因主要参与了对细菌的反应、对无机物的反应、活性氧化过程、对肿瘤坏死因子的反应、急性炎症反应等，见图5。

图5 GO功能富集分析条形图

图6和图7-1中的颜色的深浅代表富集程度，颜色越深代表富集程度越高。图7-2中不同颜色节点代表不同通路，见表5。

图6 KEGG通路富集分析条形图

图7 KEGG通路富集分析

表5 信号通路基本信息

2.6 分子对接结果与分析 将筛选出的排名前3的quercetin、kaempferol、ursolic acid 及排名前 3 的核心靶点HSPA5、MAP3K14、DHX9分别输入PUBCHEM、PDB数据库中，以结合能≤ -5.0 kJ/mol为标准，对关键活性成分和靶点进行分子对接。结果显示9组配对中两两之间对接的亲和力均小于-5.0 kJ/mol，表明药物活性成分与核心靶点之间具有较好的结合性，证明金银花-黄芪药对治疗骨髓炎科学有效，见图8、表6。选取均排名第1的quercetin和HSPA5进行对接流程展示，见图9。

图8 分子对接结果

图9 quercetin和HSPA5的对接结果

表6 分子对接能

3 讨论

骨髓炎是临床上常见的骨病之一，急性骨髓炎得到合适治疗后一般愈后较好，但治疗不彻底就转变为慢性骨髓炎，其病情迁延难愈将严重影响患者生活质量[3]。早在《黄帝内经》中就有其病因病机的记载，隋代医家巢元方将该病称为“附骨疽”并沿用至今[16]。该病基本病机为体质虚弱，邪毒内侵，壅遏成脓[8]。临床上主要治疗原则为清热解毒，益气养阴。通过对相关文献检索及临床用药总结[7-9，17]，发现金银花是常用的抗菌消炎类中药，为治疗“痈疽”的主要用药之一，也有部分学者称其为“中药抗生素”，现已发现其主要化学成分为为有机酸类、环烯醚萜类和黄酮类，多数文献[18-20]也对其提取物的抗菌消炎作用进行讨论，但研究结论较为单一。黄芪为临床上最常用的补虚类中药之一，现代药理学证实其主要化学成分包括多糖、皂苷类、黄酮类等，具有抗氧化应激、提高免疫力的功效[21]。临床中疮疡、痈疽之病，初起多实中伴虚，后期多虚中夹实。金银花善解实毒，黄芪善治虚，因此常相配伍用于治疗疮疡、痈疽。黄贵华等[17]认为金银花配黄芪，有清热解毒消肿、扶正托脓生肌之效，可用于各个时期的疮疡、痈疽。

本研究通过网络药理学的方法，从有效成分、通路和基因蛋白方面探讨金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的作用机制。首先筛选金银花、黄芪的活性成分和骨髓炎相应的靶蛋白，得到符合标准的有21个。进一步使用Cytoscape3.8.2建立金银花治疗骨髓炎的网络图，发现 quercetin、kaempferol、ursolic acid、apigenin、luteolin 5种成分与疾病的靶点相关性较高，这些有效成分主要调控成骨细胞的代谢平衡、血管的生成和凋亡、改善内环境的炎症反应等。其中槲皮素的潜在连接靶点最高，槲皮素具有抗氧化作用，能够通过清除ROS，避免其激活NF-kB和AP-1的活性而导致的细胞凋亡，从而减少氧化应激诱发的炎症反应[22]。也有学者[23]通过细胞实验发现槲皮素能够影响肿瘤坏死基因的转录和细胞白介素的分泌，改善早期骨髓炎的症状。多数慢性骨髓炎患者病情反复，其重要原因之一为免疫力低下[24]。山柰酚作为最常见的黄酮类化合物，具有良好的抗菌活性，尤其对耐甲氧青霉素的金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用。慕静静等[25]通过在体实验证实了山柰酚能够调控T淋巴细胞体外活化和增殖，改善机体免疫力。王倩等[26]发现木犀草素能抑制DNA拓扑异构酶的活性，影响菌体核酸及蛋白质的合成，有效抑制金黄色葡萄球菌的活性。乔林等[27]提出金黄色葡萄球菌是慢性骨髓炎的最主要致病菌，因此中药治疗骨髓炎可能是通过杀灭金黄色葡萄球菌实现的。综合来看，金银花-黄芪药对的活性成分功能集中在抗氧化应激、提高免疫力、减少细胞凋亡、抗炎抗菌4个方面。

对 PPI网络分析可知，HSPA5、MAP3K14、DHX9等蛋白可能为金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的关键靶点。HSPA又被称为免疫球蛋白重链结合蛋白，其定位在细胞内质网上，作为钙离子结合蛋白能辅助蛋白质恢复正常的构象，在应激状态下转移内质网内的错误折叠蛋白，维持内环境的稳态[28]。同时也有研究[29]发现，HSPA5能降低细胞对杀伤性T细胞的敏感程度来抑制细胞凋亡。樊凤艳等[30]通过在体实验证实了HSPA5的表达能够抑制炎性因子mRNA的表达，为中药调控HSPA5治疗骨髓炎提供了理论依据。MAP3K14属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）超级家族，参与信号的跨膜传导，与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关[31]。曹洪庆等[32]通过体外实验发现MAP3K14能够调节miR-17-5P的表达参与细胞的凋亡。LIU等[33]也通过实验证实了MAP3K14能介导炎性细胞死亡，控制炎症。DHX9又称为核DNA解旋酶II或RNA解旋酶A，主要由DExH解旋酶和DExD解旋酶构成，在核糖核酸的转录翻译等方面起着重要的调控作用。研究[34]表明DHX9能够激活P53信号引起凋亡或衰老反应。多数研究结果表明，细菌、炎症和免疫力低下是骨髓炎发病的关键因素，佐证了金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的科学性。

GO富集结果表明金银花-黄芪药对与细菌的反应、对无机物的反应、活性氧化过程、对肿瘤坏死因子的反应、急性炎症反应密切相关。现代研究[35]证实骨髓炎的发病主要是因为创伤或异物的存在引起细菌大量繁殖而诱发强烈的炎症反应，而本研究结果也证实了金银花-黄芪药对治疗骨髓炎是通过抗菌、消炎、抗氧化、提高免疫力等途径实现的。KEGG通路富集结果同样验证了以上结论，KEGG通路主要涉及TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、结核通路等。

分子对接结果显示，金银花-黄芪药对的有效成分（quercetin、kaempferol、ursolic acid）与（HSPA5、MAP3K14、DHX9）自发结合，且结合活性较强（均＜-5.0 kJ/mol），提示金银花-黄芪药对能够调控骨髓炎的相关靶点蛋白治疗骨髓炎，验证了网络药理学筛选的金银花-黄芪药对治疗骨髓炎的核心靶点的科学性。

综上所述，金银花-黄芪药对确实能多靶点、多途径治疗骨髓炎，主要通过抗氧化应激、提高免疫力、减少细胞凋亡、抗炎抗菌4个途径来发挥治疗作用。金银花、黄芪的多种有效活性成分之间密切联系，在治疗骨髓炎的过程中共同发挥着重要作用。