勾旭升，李华哲，李 觅，张 睿，陈立民

（哈尔滨医科大学附属第四医院骨科，黑龙江哈尔滨 150001）

软骨肉瘤是来源于软骨细胞的恶性肿瘤，患病率占全部恶性骨肿瘤的16.1%［1］，好发于长骨近端及四肢带骨，常见于40～70岁中老年人［2］。因其对放化疗不敏感，常需要手术切除及肢体重建［3］。但微小病灶的残留易造成肿瘤的复发及转移，因此寻找有效抑制软骨肉瘤的药物成为骨肿瘤领域亟待解决的问题。槲皮素是存在于多种中药及食物中的黄酮类化合物，近年来研究表明，槲皮素能够有效抑制肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、骨肉瘤等肿瘤细胞，但其作用机制尚存在争议［4～5］。为此，本研究将槲皮素加入体外培养的软骨肉瘤细胞，观察其对细胞线粒体功能的影响，并探讨其作用机制，为软骨肉瘤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组处理

软骨肉瘤细胞（SW1353）源自美国菌种保藏中心（ATCC），槲皮素、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）激动剂740Y-P购自美国MedChemExpress公司，Western检测抗体购自沈阳万类公司，其余试剂均购自上海碧云天公司。细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，5%CO2、37℃条件下培养。待细胞铺满80%培养瓶后传代。将细胞随机分为加药组、激动剂组、空白对照组，每组6个样本。加药组加入200 μg/ml槲皮素；激动剂组加入200 μg/ml槲皮素及20 μmol/L 740Y-P；空白对照组仅SW1353作为空白对照。药物干预48h后对细胞各项指标进行检测。

1.2 细胞活性检测

细胞活性检测采用CCK-8试剂盒。3组细胞消化后，各取100 μl加入96孔板中，37℃孵育24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育1 h后，酶标仪（Bio-Rad iMark，美国）测定各孔样本在450nm处的吸光值（A），以A测得值-A空白孔为各孔实际吸光值A450。并计算各样本细胞活力，细胞活力（%）=（A加药组或激动剂组-A空白孔）/（A空白对照组-A空白孔）×100%，其中A空白对照组取空白对照组6个样本的平均值。

1.3 线粒体膜电位检测

线粒体膜电位（ΔΨm）检测采用JC-1荧光探针。调整细胞浓度为1×108/L，取0.5 ml加入0.5 ml JC-1工作液混匀。37℃孵育20 min，600g、4℃离心4 min，向沉淀中加入1 ml JC-1缓冲液（1X），再次600 g、4℃离心4 min，洗涤两次。加入1 ml JC-1缓冲液（1X）重悬，取200 μl加入96孔板中，使用荧光分光光度计（Hitachi F4500，日本）测量JC-1单体 （A单）和聚合体（A聚）吸光值。A单激发光490 nm，发射光530 nm；A聚激发光525 nm，发射光590 nm。以A聚/A单的比值评估ΔΨm水平。

1.4 细胞内活性氧检测

细胞内活性氧（ROS）水平检测采用活性氧检测试剂盒。调整细胞浓度为1×108/L，取1 ml，600 g、4℃离心4 min，弃上清。根据试剂盒说明书，1 μl DCFH-DA加入1 ml DMEM/F12后重悬、混匀，37℃中孵育20 min。孵育后600 g、4℃离心4 min，弃上清，DMEM/F12培养基洗涤3次。取200 μl加入96孔板中，荧光分光光度计测量吸光值（AROS）。激发光波长488 nm，发射光波长525 nm。

1.5 p-Akt表达水平检测

使用Western blot方法检测Akt、p-Akt表达水平。细胞裂解后测定样本蛋白含量。煮沸后-80℃保存备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。TBST洗膜后分别加入抗 Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶500）一抗 4℃孵育过夜。加入IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。ECL化学发光试剂盒曝光后，使用Image J 1.5b软件分析灰度值。以p-Akt/Akt比值评价p-Akt表达水平。

1.6 细胞凋亡检测

采用Western blot方法测定细胞内Bax、Bcl-2表达水平。提取细胞内的总蛋白后，经电泳、转膜、封闭、洗膜后，加入抗Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）一抗4℃孵育过夜，GAPDH（1∶2 000）作为内参。加入IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2h。ECL曝光后，使用Image J 1.5b软件分析灰度值。以Bax/GAPDH、Bcl-2/GAPDH比值评价细胞凋亡水平。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 槲皮素对细胞活性影响

空白对照组SW1353细胞排列密集，细胞间多呈三角形排列；加药组细胞密度减低，细胞间排列混杂，无规律；激动剂组细胞形态介于二者之间。细胞活性检测结果见表1，三组A450比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中加药组细胞A450低于激动剂组及空白对照组，激动剂组A450低于空白对照组，差异均有统计学意义。以空白对照组为参考计算细胞活力，加药组细胞活力低于激动剂组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 细胞活性检测结果（±s）

表1 细胞活性检测结果（±s）

images/BZ_67_1301_2566_1486_2635.pngimages/BZ_67_1486_2566_1674_2635.pngimages/BZ_67_1674_2566_1901_2635.pngimages/BZ_67_1901_2566_2129_2635.png指标A450加药组0.48±0.11激动剂组0.73±0.13空白对照组0.92±0.13 P值<0.001 0.005

2.2 槲皮素对线粒体膜电位的影响

加药组 ΔΨm（0.69±0.04）低于激动剂组（1.11±0.11）及空白对照组（1.18±0.09），三者比较差异有统计学意义（P<0.001）。组内比较，加药组ΔΨm明显低于激动剂组（P<0.001）及空白对照组（P<0.001，差异均有统计学意义。激动剂组与空白对照组比较，二者差异无统计学意义（P=0.203）。

2.3 槲皮素对细胞内活性氧的影响

加药组细胞内ROS含量（0.64±0.07）高于激动剂组（0.57±0.03）及空白对照组（0.54±0.04），三者比较差异具有统计学意义（P=0.008）。组内比较，加药组ROS高于激动剂组（P=0.024）及空白对照组（P=0.003），差异均有统计学意义。激动剂组与空白对照组ROS比较，二者比较差异无统计学意义（P=0.288）。

2.4 槲皮素对p-Akt表达水平影响

槲皮素对p-Akt表达水平影响见图1。加药组p-Akt相对表达水平（0.57±0.04）明显低于激动剂组p-Akt（0.62±0.02） 及空白对照组 p-Akt（1.03±0.05），三者比较差异具有统计学意义（P<0.001）。加药组表达水平低于激动剂组（P=0.016）及空白对照组（P<0.001），差异具有统计学意义；激动剂组表达水平低于空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图1 槲皮素对Akt蛋白表达的影响

2.5 槲皮素对细胞凋亡的影响

槲皮素对细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2表达的影响见图2及表2。三组Bax表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.001）。其中加药组Bax表达水平高于激动剂组及空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.001）。激动剂组Bax表达水平与空白对照组比较，二者差异无统计学意义（P=0.674）。三组Bcl-2表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.001）。其中加药组Bcl-2表达水平低于激动剂组及空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.001）。激动剂组Bcl-2表达水平低于空白对照组，差异具有统计学意义（P=0.003）。

表2 槲皮素对凋亡蛋白表达的影响（±s）

表2 槲皮素对凋亡蛋白表达的影响（±s）

images/BZ_68_206_3247_357_3313.pngimages/BZ_68_357_3247_552_3313.pngimages/BZ_68_552_3247_770_3313.pngimages/BZ_68_770_3247_1032_3313.png指标Bax加药组1.33±0.10激动剂组0.97±0.04空白对照组0.99±0.08 P值<0.001<0.001

图2 槲皮素对凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

槲皮素又名槲皮黄素，多以甙的形式存在于多种植物的花、叶及果实当中［6］。槲皮素具有多种生物活性，包括抗炎、抗病毒、抗细胞氧化、抗肿瘤增殖等，其中抗肿瘤作用成为近年来研究热点［7］。国内外多种研究表明，槲皮素可通过抑制细胞信号通路，下调癌基因表达，干扰细胞周期，调节细胞凋亡等多种途径发挥作用［8］。证实其在体外环境下能够抑制胃癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的增殖［9］。本研究通过将槲皮素作用于软骨肉瘤细胞，证实其在体外可通过调节PI3K/Akt通路降低细胞内线粒体功能，加速细胞凋亡。

线粒体是产生ROS的重要细胞器，当其代谢功能出现障碍时，细胞供能减少，线粒体内ROS、细胞色素c等物质释放进入胞浆，启动细胞程序性死亡［10］。本研究中采用JC-1检测线粒体ΔΨm水平，由结果可见，加药组ΔΨm明显降低，说明槲皮素能够降低线粒体膜电位。当ΔΨm降低时，电子传递链的传递效率减慢，电子从呼吸链逸出，与线粒体内氧分子结合产生大量ROS，同时复合体V不能依靠质子回流合成ATP，出现细胞供能减少。聚集的ROS导致线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放，胞浆内水进入线粒，造成线粒体肿胀破溃，ROS进入细胞内诱导凋亡的发生。Bax与Bcl-2是一对凋亡相关蛋白，Bax具有促凋亡作用，Bcl-2具有抗凋亡作用［11］。本研究加药组Bax表达增高，Bcl-2表达降低，说明槲皮素能够通过改变线粒体功能进而加速软骨肉瘤细胞的凋亡，进而达到抗肿瘤的作用。

为进一步探讨槲皮素对线粒体功能影响的作用机制，本研究分析了PI3K-Akt这一重要线粒体调节通路。PI3K是一种广泛存在于细胞内的磷脂酰肌醇激酶，兼具有磷脂酰肌醇激酶和丝/苏氨酸激酶活性，当其受到上游酪氨酸激酶的信号激活后使Akt丝/苏氨酸磷酸化位点磷酸化，形成激活态的p-Akt［12］。p-Akt进一步激活下游雷帕霉素靶蛋白mTOR，从而调节线粒体介导的细胞凋亡。由本研究结果分析槲皮素抑制了Akt磷酸化，进而导致线粒体功能下降，ΔΨm减低，ROS增多，从而启动线粒体凋亡程序。而加入Akt激动剂后，线粒体功能明显改善，ΔΨm增高，ROS减少，说明槲皮素通过抑制PI3K/Akt抑制线粒体的功能，进而诱导软骨肉瘤细胞的凋亡。然而，由于细胞通路存在交互作用，槲皮素可能存在作用于其他的靶蛋白，或通过Wnt/β-catenin、MAPK/ERK1/2等其他信号通路发挥作用［13，14］，尚需进一步研究。

综上所述，槲皮素能够通过调节PI3K/Akt通路，降低软骨肉瘤细胞线粒体的生理功能，启动线粒体诱导的细胞凋亡程序，从而达到抑制软骨肉瘤细胞增殖的作用。