王共强，汪世靖，马心锋，韩咏竹，杨任民

安徽中医药大学神经病学研究所 安徽合肥 230061

肝主疏泄与铜稳态失调

肝主疏泄理论是在古代医家不断总结既有学说并结合临床实践反复验证，最终抽象概括的基础上才得以确立的。肝主疏泄在昼夜节律调控下的人体卫气和血液的运行和分布也有着昼夜节律的变化[1]。松果体通过分泌褪黑素调节相关神经-内分泌-免疫网络，从而完成了肝应五时而变功能的内在调节机制。其调控与神经内分泌系统有关，并有各种神经递质、激素的参与，有其生理学基础，肝主疏泄应五时而变是多网络多层次的复杂联系[2-3]，但其具体微观相关物质基础包括金属离子稳态等尚需进一步研究。

铜稳态失调涉及多种疾病，包括癌症、糖尿病、神经系统退行性疾病（阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等）及Wilson病（Wilson's disease，WD）等。线粒体及三磷酸腺苷（ATP）也受到生物钟的控制，细胞需要通过线粒体融合的互补作用来抵抗衰老。Cu转运蛋白ATPase的表达表现出明显的昼夜节律性[4]。若是线粒体之间分裂-融合的动态平衡受到干扰，可能会导致健康问题，而介导线粒体分裂及融合的关键基因DRP1的磷酸化在线粒体生物节律调控中其中关键作用[5]。线粒体铜负荷的不断增加可能严重影响这些细胞器，如同Wilson病（Wilson’s disease，WD）一样，肝铜超载会导致肝细胞线粒体破坏，肝细胞死亡引起肝衰竭，尤其是在WD和动物模型肝脏中，线粒体逐渐受损的生化功能是肝脏细胞死亡的关键因素[6]。因此，有必要揭示铜稳态失调导致细胞最初是如何试图抵消这种铜超载引发的线粒体衰变的，它们为什么最终失败以及昼夜节律在其间的调控作用。

WD作为铜稳态失衡相关疾病研究最佳模型之一，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，在以D-青霉胺、曲恩汀等为代表的铜螯合药物治疗WD临床提高了疗效，但仍有超过20%患者出现症状加重，同时还要预防过度螯合引发铜缺乏等毒副作用。为此，有学者提出WD治疗策略的变革，不再提倡驱铜疗法以去除堆积的铜，而是使血液中的游离铜离子浓度常态化以逆转铜中毒[7]。近年来学者不断尝试探索非螯合治疗方法以减少目前螯合治疗的毒副作用，比如生物聚合物8-羟基喹啉、α-硫辛酸、甲烷菌素等在动物实验取得初步疗效，近期有学者提出抗氧化剂褪黑激素可以充当铜螯合剂的研究假设[8]。因此，如何尽快恢复WD患者铜稳态平衡以及筛选最佳铜螯合治疗条件是目前急需解决的科学问题。随着精准医疗理论的展开，如何精确了解铜代谢的途径及铜稳态维持的机制，研究将为以WD代表的铜稳态失调相关疾病尝试建立更有效、安全、经济“精准驱铜”的螯合治疗时效模式[9]，对帮助其病情恢复和提高生活质量具有重要的临床意义。

WD为肝失疏泄之病机理论的探索

祖国医学文献中尚未见WD有明确的记载，依据本病多见的腹痛、黄疸、腹水、言语不清、手抖、流涎、肢体扭转、情绪障碍、精神行为异常等多种临床症状及体征，可将该病归于“强直”“颤振”“癫狂”“黄疸”“积聚”等范畴。历来医家多认为本病病因是由于先天禀赋不足，脏腑气血功能失调所致。杨任民等[10]根据大多数WD患者所表现出目黄、口中发苦、晨起口气、尿黄、便秘、舌红苔黄腻、脉弦数或弦滑等证候，推断本病主要病因病机为铜毒内蕴而导致日久肝胆湿热，聚而不散为病。作者团队前期从络病理论出发认为WD病机在于毒损络脉，其演变过程有毒邪伏络期、毒损肝络期、肝络瘀阻期、毒邪逆传期四个时期。邪毒属于内生伏毒，“铜毒”只是发病的始动之毒，除“铜毒”之外还有各种级联内生之毒，提出扶正解毒通络的基本治疗原则[11]。肝主疏泄功能存在季节性的变化，通过自身的季节性变化引起气血津液以及各项身体机能随之发生变化，认为这种季节性改变的生理机制是与机体神经内分泌活动密切相关[12]，临床上躯体外伤及精神刺激等创伤应激常是诱发WD病情发生和加重的主要因素，可见，这与肝失疏泄导致铜毒在体内的重新分布有关[13]。“肝主疏泄”最早来源可追溯到《黄帝内经》，泛指肝脏通过肝气疏通畅达全身气机，从而调节全身气血精津液的运行输布，又对脾胃的运化、肺气的升降、肾精的封藏等脏腑功能起到重要的调节作用。肝主疏泄的核心是调畅气机，中医学“天人相应”，“五脏应时”，其中肝应春的实质是肝气疏泄的功能在春季加强，推动气血津液升发，以适应春 “生”之气; 在其他季节则是通过肝主疏泄对气的调控功能随季节而变化，协同其他四脏共同完成对人体气机的调节，从而适应自然界生、长、化、收、藏的季节变化。从情志病季节性发病的角度探索肝主疏泄功能发现与之相对应的下丘脑-垂体分泌的褪黑素呈现季节性分泌的变化趋势，由此体现肝主疏泄四季变化的趋势[14]。而昼夜与四季也存在相似的变化，根据中医“子午流注”理论，子午流注即人体气血于十二时辰间在经脉中流动的盛衰现象，因此，肝主疏泄调控下人体卫气营血的运动和分布也有着昼夜节律的变化[15]。

线粒体铜稳态与昼夜节律

铜作为一种重要的微量元素，在细胞内作为细胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase CcO）和铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase SOD1）合成的辅助因子参与氧化还原反应，而线粒体作为细胞氧化还原反应的重要细胞器，是细胞内存储、利用铜的主要场所，而线粒体需要维持氧化还原的稳定，必须要有维持一个恒定的铜稳态，而当机体铜稳态出现异常时，细胞内过量蓄积的铜也会有线粒体来处理，此时，线粒体内铜稳态被破坏，进而引起线粒体氧化应激的增强，活性氧的大量产生，最终导致细胞死亡。目前研究认为，参与线粒体铜转运的相关蛋白主要有：铜伴侣蛋白细胞色素氧化酶（COX）17、19、23，他们均是含有半胱氨酸残基的可溶性小蛋白，它们与Cu（I）结合，参与CcO和SOD的装配；或通过谷胱甘肽（glutathione，GSH）和阴离子非蛋白铜配体（anionic non-protein copper ligand，GuL）进入线粒体，而后两者的具体转运方式目前尚不明确[5]。而WD作为铜代谢障碍引发铜稳态失调疾病，过量铜蓄积导致肝脑损伤是其重要的病理基础，而铜过量导致细胞氧化应激损是其重要的病理机制。目前，有关铜离子昼夜节律变化的研究尚不明确，铜离子在细胞内外稳态的调节可能是通过铜转运蛋白Ctr1和ATP7A蛋白的昼夜表达来实验，但此想象仅在植物体内发现，尚未见动物细胞的发现[16]，其中复杂的调控机制尚有待进一步研究证实。

近年来，时间生物学是研究热点，下丘脑视上交叉核（SCN）是调节机体昼夜节律的中枢部位，光照及环境变化均是刺激其生物活动的重要外界因素，通过复杂的环状调控机制调节机体适应外界环境的变化，这与中医学“天人合一”的整体观念一致[17]。目前发现了与昼夜节律相关的基因有CLOCK、Bmal1、Per1/2/3、Cry1/2等，其中Clock/Bmal1是重要的上游基因，可以启动下游基因Pers、Crys的表达产生正反馈的昼夜节律，而负反馈机制相对复杂，除下游Pers/Crys基因的激活外，机体的代谢、氧化应激反应等均可参与[18]。研究发现，亮氨酸拉链家族的核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 relatedfactor 2，Nrf2）作为一种转录因子，是细胞发生氧化应激反应的关键因子及中枢调节者，正常情况下Nrf2是以无活性的形式与Keap1结合复合物，当细胞氧化应激增强时，细胞内重要的能量调节感受器磷酸腺苷蛋白活化激酶（AMPK）被激活，后者可加速Nrf2与Keapl解离，促使Nrf2发生核转位进入细胞核，与抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE）结合，转录抗氧化和细胞保护的基因，发挥抗氧化保护作用[19]。当而当机体处于昼夜节律失衡出现氧化应激增强时，节律基因Bmal1可以上调Nrf2的表达，进而产生抗氧化作用，而后者可通过激活线粒体沉默信息调节因子3（Sirt3）的表达，促进线粒体mDNA的表达，激活超氧化物歧化酶（SOD2），减少GSPx的产生，发挥抗氧化作用，同时，Nrf2又能够上调Per2和Cry2的表达，发生昼夜节律的负反馈调节作用[20]。除外受昼夜节律中枢的调控之外，机体其他脏器亦具有自身独立的昼夜调节机制，如高通量转录组学和代谢组学研究表明，肝脏具有独特的昼夜节律调节功能，对代谢过程如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）补救途径和糖原转换具有特异性。研究证明在其他组织生物钟功能丧失的情况下，肝脏昼夜节律的自律性也可以维持一定的功能，并可以独立于中枢生物钟而对光照改变做出应答，监测昼夜光强度的变化而行使组织功能[21]。生物体铜转运蛋白表达存在昼夜节律变化，受到细胞代谢、氧化应激等多种因素的影响，从节律基因表达环路的中实现铜转运蛋白表达的调控，而Nrf2作为重要的核转录因子，在铜蓄积导致的氧化应激损伤中发挥保护作用，激活下游Sirt3发挥线粒体保护作用，同时阻断上游的AMPK磷酸化以及参与节律基因Per2和Cry2表达的调控。因此，明确线粒体铜的转运通路昼夜节律变化及其机制，对于引导螯合治疗以及寻找最佳螯合时效具有重要意义。

展 望

肝的疏泄功能与生命活动息息相关，参与人体气血运行、水谷运化、水液代谢、精神情志活动等。WD主要病机为先天禀赋不足，后天运化失常，铜毒内聚伤及脏腑，并根据患者主要表现从肝胆湿热、经脉瘀阻入手，创立以清热解毒、通腑利湿为治法治则的方剂肝豆汤，使患者临床改善率明显提高[22]。中西医观的不同对时间生物学的研究提供了新的研究思路，同时时间生物学也为研究中西医结合提供了广阔的前景。通过梳理肝主疏泄的昼夜节律，探究WD其生理病理机制。同时也将为AD、PD等其他铜稳态失调相关疾病寻找新的治疗思路和借鉴，并结合临床研究，寻求新的组方思路，对临床具有重要的指导意义。因此，从现代医学细胞分子生物学层面，结合时间医学相关研究结果与肝主疏泄功能和铜稳态平衡结合进行交叉研究，以阐述肝主疏泄对线粒体铜稳态昼夜节律调控的科学内涵，对揭示肝主疏泄从多层次、多因素统一认识机体整体调节规律的深层内涵具有重要意义。