王飞，刘建雄 ，王明明，乔栎

1 甘肃中医药大学，甘肃兰州730030；2 甘肃省人民医院

脑卒中是目前致残率和致死率最高的疾病之一，其临床上可分为缺血性和出血性。脑梗死是脑缺血卒中疾病，占全部脑血管病的70%，其致残率可达50%～70%［1］，存活者40%可复发，卒中复发频率与病死率和致残率呈正相关。研究［2］显示，血脑屏障（BBB）由排列在脑毛细血管上的内皮细胞组成，脑梗死后BBB 的破坏及其渗透升高是由炎症反应、氧化应激物的生成、基质金属蛋白酶-9 的激活等一个复杂过程形成的。研究［3-6］显示，大黄能清除氧自由基、降低血管通透性、减少脑组织损害，有钙离子拮抗等作用，而且大黄能降低脑梗死大鼠脑组织中NF-κB 和细胞间黏附分子-1 等炎症因子，可改善BBB损伤和减轻脑水肿。BBB结构与功能的基础是脑微血管内皮细胞之间的紧密连接，由闭锁蛋白（Occludin）、claudin 蛋白和连接黏附分子（JAMs）构成，其中Occludin 是BBB 紧密连接中最重要的蛋白［7-10］。研究［11］显示，Occludin 在脑内皮细胞高表达，而在非神经内皮细胞中低表达，对BBB 的通透性起着重要的调节作用。近年对于Occludin的研究主要集中在脑肿瘤、脑出血、多发性硬化等方面［12］，关于脑梗死的研究很少。2019 年12 月2 日—2020年9 月14 日，本研究观察了大黄提取物灌胃对脑梗死大鼠BBB的保护作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠分组、脑梗死模型的建立及大黄提取物给予方法 选取甘肃中医药大学动物实验室提供的SPF 级 SD 雄性大鼠 180 只，体质量 250～280 g。SD大鼠按需进食及饮水，饲养环境相同，喂养1周适应后用于动物实验。将180 只大鼠随机分为假手术组、模型组、大黄组，每组60 只。模型组和大黄组大鼠采用经典longa＇s 线拴法制备脑梗死模型［13］。大鼠脑梗死模型建立成功的特点是上肢屈曲，行走时向左旋转，清醒时左侧肢体瘫痪。假手术组大鼠颈总动脉与颈内、颈外动脉分离后，不结扎大脑中动脉。成功建立动物模型后，每天上午9：00 和下午 17：00 分别给大鼠灌胃，大黄组给予2.5 mL 大黄提取物灌胃，假手术组、模型组给予2.5 mL 生理盐水灌胃。各组在建模后第1、3、5、7、10 天随机设置5 个时间点，每个时间点取10 只大鼠用于实验研究。本研究经甘肃中医药大学医学伦理委员会批准。

1.2 各组大鼠神经功能评分 采用Longa 评分法［13］，对各组大鼠进行神经功能评分。无神经功能缺损记0 分，左前爪不能完全伸展记1 分，行走时转向左侧障碍记2 分，行走时向左侧倾倒记3 分，无法行走或失去意识记4分，死亡记5分。

1.3 各组大鼠脑组织中伊文思蓝（EB）渗出量测算 建模后第 1、3、5、7、10 天随机选择5 只大鼠，在处死前30 min 通过尾静脉静脉注射2% EB（2 mL/kg），处死后用甲酰胺浸泡法［14］测算大鼠脑组织中EB渗出量。

1.4 各组大鼠脑梗死区Occludin mRNA 检测 采用 Real-time PCR 法。建模后第 1、3、5、7、10 天随机选择5 只大鼠，通过快速断头和开颅手术获得脑组织，将脑组织置于用DEPC 处理的培养皿上，分离右脑组织，取脑梗死区100 mg 脑髓质放入冷冻保存管中，浸入液氮后−80 ℃储存。取大鼠脑梗死区组织，TRIzol 法提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书步骤逆转录为 cDNA，以 β-actin 为内参，进行 PCR 反应。引物序列如下：Occludin 正向引物为5′-ACG⁃GTGCCATAGAATGAGATGTTG-3′，反向引物为5′-CAGCTAGTTGTTCATTTCTGCACCA-3′；β -actin 正向引物为 5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，反向引 物 为 5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。 Realtime PCR 反应体系：荧光染料 10 μL，cDNA 产物2 μL，10 μmol／L 目的基因引物各1 μL，DEPC 处理双蒸水 6 μL，共 20 μL。以 2−ΔΔCt表示大鼠脑梗死区Occludin mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料以表示，比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 各组大鼠神经功能评分比较见表1，由表1 可知，假手术组大鼠神经功能评分均为0分，神经功能未受损伤；模型组大鼠第1 天神经功能评分明显升高，第3 天达峰值，第5 天开始下降；大黄组大鼠每个时间点的神经功能评分均低于模型组（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，）

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组大黄组神经功能评分第10天0 2.01±0.79*1.01±0.12*#第1天0 1.98±0.31*1.53±0.18*#第3天0 2.41±0.28*1.74±0.20*#第5天0 2.35±0.11*1.49±0.14*#第7天0 2.13±0.21*1.37±0.09*#

2.2 各组大鼠脑组织中EB渗出量比较 各组大鼠脑组织中EB渗出量比较见表2。由表2可知，假手术组大鼠脑组织中EB渗出量较少，且各时间点无变化；模型组大鼠第1天脑组织中EB渗出量明显升高，第3天达峰值，第5天开始下降；大黄组大鼠每个时间点的脑组织中EB渗出量均低于模型组（P均＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织中EB渗出量比较（%，）

表2 各组大鼠脑组织中EB渗出量比较（%，）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别脑组织中EB渗出量第1天0.95±0.12 2.75±0.10*2.57±0.22*#第5天0.93±0.09 2.44±0.30*2.12±0.09*#第10天0.94±0.12 1.99±0.15*1.74±0.15*#第3天0.94±0.13 3.31±0.14*2.30±0.15*#第7天0.95±0.10 2.23±0.21*1.93±0.10*#假手术组模型组大黄组

2.3 各组大鼠脑梗死区Occludin mRNA 相对表达量比较 各组大鼠脑梗死区Occludin mRNA相对表达量比较见表3。由表3 可知，假手术组大鼠脑梗死区Occludin mRNA 相对表达量在各时间点无明显变化趋势；模型组大鼠第1 天脑梗死区Occludin mRNA 相对表达量开始下降，第3 天最低，第5 天后开始升高，第10 天时接近假手术组；大黄组大鼠每个时间点的脑梗死区Oc⁃cludin mRNA 相对表达量均高于模型组（P均＜0.05）。

表3 各组大鼠脑梗死区Occludin mRNA 相对表达量（）

表3 各组大鼠脑梗死区Occludin mRNA 相对表达量（）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组大黄组脑梗死区Occludin mRNA相对表达量第10天0.89±0.17 0.75±0.19*0.83±0.12*#第1天0.89±0.10 0.32±0.03*0.43±0.11*#第3天0.90±0.23 0.28±0.10*0.59±0.14*#第5天0.86±0.06 0.43±0.13*0.68±0.13*#第7天0.88±0.04 0.53±0.04*0.71±0.11*#

3 讨论

脑梗死是由于多种原因导致局部动脉血流减少或停止，致使供血区的脑组织缺血、缺氧的状态，导致后期出现肢体偏瘫、失语等神经功能缺损的症状［1］。BBB 结构与功能的基础是脑微血管内皮细胞之间的紧密连接［15］，由Occludin、claudin 蛋白和连接黏附分子构成，各种内源、外源的信号通路通过调节这些蛋白达到对BBB 通透性的调节。生大黄的主要成分是蒽醌衍生物［5～6］，其主要功能是解热、洗胃、活血化瘀。研究［16］显示，大黄可以抑制线粒体凋亡，从而抵抗缺氧所致的大鼠海马组织的损伤；同时可以通过下调HIF-1α 减轻脑缺血缺氧的损伤范围，使得加速梗死区神经细胞的恢复。在本研究过程中，模型组大鼠神经功能评分趋势是：第1 天大鼠神经功能评分明显升高，第3 天时达峰值，第5 天评分下降，第10天时最低。在每个时间点大黄治疗脑梗死后的神经功能评分均显著低于模型组，说明大黄可以使小鼠的神经功能损伤程度得到有效地改善。我们分析认为，这可能与大黄可以抑制脑组织线粒体的凋亡，从而减少缺氧所致的脑梗死损伤以及加速神经细胞的恢复有关，这说明大黄对于脑梗死后神经损伤减轻和神经功能的恢复有显著作用。

研究［17］发现，在缺血性脑卒中再灌注发生后致APT能量不足并使作为BBB基础结构的血管内皮的肌动蛋白聚合、肌球蛋白磷酸化，产生肌动蛋白收缩，细胞结构受损，则BBB 的通透性增加。在缺血性脑卒中患者脑组织中，氧化应激产物活性氧簇增加致使内皮细胞受损，细胞因子可直接致使紧密连接蛋白 Claudin-5 及 Occludin 降解，IL-6 激活 NF-κB增加细胞黏附因子，可增强外周白细胞通过BBB 损伤部位从而增加入侵的能力。脑卒中患者严重者处于绝对卧床休息时，其胃肠道处于抑制状态，致使肠道内毒素吸收增加，脑内的内毒素亦增加。研究［18］显示，大黄有肠道泻下的作用，可排空胃肠道、改善脑组织缺血缺氧的状态，同时也可以修复胃黏膜，减轻应激性消化道溃疡。脑组织的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可以通过血脑积液屏障进入，可以抑制大鼠皮质细胞释放乳酸脱氢酶，降低线粒体的活性，直接发挥对脑组织的保护作用。大黄及大黄制剂的有效成分可抑制大鼠细胞外钙离子内流，抑制血小板聚集，能提高脑缺血再灌注大鼠血清一氧化氮含量和脑组织一氧化氮合酶活性，降低脑组织含量，改善脑组织损伤；大黄注射液能显著改善花生四烯酸诱导的脑缺血大鼠血液流变学，降低血小板聚集，抑制血栓素A 合成，降低血栓素A/前列腺素比值，减轻脑水肿，降低死亡率。本研究发现，脑梗死后第1天Occludin mRNA 相对表达量明显下调，第3天表达最低，第5 天开始明显升高，但大黄组的Occludin mRNA 较模型组的各个时间点均增加；同时比较脑组织中EB 渗出量，发现模型组大鼠第1 天脑组织中EB 渗出量明显升高，第3 天达峰值，第5 天开始下降；大黄组大鼠每个时间点的脑组织中EB渗出量均低于模型组，说明脑梗死后由于炎性因子和凝血酶破坏BBB，使Occludin mRNA 发生酪氨酸磷酸化导致表达降低，同时BBB 受损导致EB 渗出增加，但大黄可阻止内皮细胞受损，降低Occludin mRNA 的分解，减轻BBB 受损。同时，由于缺血缺氧，紧密连接蛋白表达降低，BBB 通透性与Occludin mRNA 表达趋势相反，这可能与大黄素通过BBB 进入细胞内降低线粒体的活性，直接对脑组织缺氧产生保护作用，并通过改变血流动力学减轻脑水肿有关。

综上所述，大黄提取物灌胃可改善脑梗死大鼠的BBB 通透性，其机制可能与大黄提取物阻止脑梗死区Occludinm mRNA 的降解有关。本研究揭示了大黄灌胃对脑梗死大鼠BBB 的保护作用，可以为脑梗死的临床治疗提供新的实验支持和理论依据。