李 丹，李 佳，吴 松

(湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是常见的以腹痛、腹胀和腹泻为主症的功能性肠病。临床IBS患者占消化门诊量的30%～50%,且发病率逐年上升[1]，IBS临床证型复杂，但多与脾虚相关。脾胃虚寒型IBS多由外感或内生寒邪伤及脾阳，导致机体免疫功能低下，临床常反复发作,其发病机制未完全明确。研究表明[2-4]，当病邪侵袭机体时，肠道粘膜启动保护机制的同时肠粘膜的紧密结构也会遭到破坏，肠粘膜上的紧密连接蛋白(ZO-1)、闭合蛋白(Claudin-1)和闭锁蛋白(Occludin)等相关蛋白也会减少，肠道通透性改变可引起高敏感性。另外炎症激活的肥大细胞释放的大量5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HAII)会引起内脏的高敏感性及肠道动力障碍。IBS目前缺乏确定的治疗方案和特异性药物。研究表明[5]中医治疗IBS效果显著，但针灸治疗IBS机制尚不清楚，多从缓解肠道炎症和增强免疫功能等方面论述。中医辨证施治可缓解IBS大多症状，减少复发。实验证明[6-7]对机体热敏感的穴位进行施灸可有效治疗IBS。本次研究选择对足三里、神阙等穴进行艾灸干预，以AWR、5-HT、5-HAII、occludin、claudin-1和肠道的超微结构为观察指标，探讨中医外治法艾灸对IBS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

购SPF 级10周龄体质量相近的 Wistar大鼠 30只。适应性喂养3 d后，随机平均分为 3组，空白对照组、模型组和艾灸组。动物饲养在湖北中医药大学标准动物房中进行，生产合格证号：SCXK(鄂)2018-0026，环境安静，温度和湿度适宜。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 10F双腔导尿管(康乐保医疗用品有限公司)；压力换能器(成都泰盟软件有限公司)；冷冻离心机(Kendro Labrotary公司，德国)；组织脱水机、组织包埋机(Thermo Scientific公司，美国)；切片机(徕卡显微系统贸易有限公司)；恒温摊烤片机(湖北安立信医疗有限公司有限责任公司)；BX53型生物显微镜(Olympus公司，日本)；T-100型PCR仪(Bio-Rad 公司，美国)。

1.2.2 试剂 艾条(10 mm×12 mm)、PBS缓冲、电泳缓冲液、转膜液、ECL显影液、染色剂、occludin抗体、claudin-1抗体、细胞分离液和裂解液、ELISA试剂盒。

1.3 模型制备

D-IBS多由多种致病因素共同刺激下发生，故选用单一刺激方式制备IBS大鼠模型存在局限，本研究用束缚应激联合冰水游泳和番泻叶灌胃制备脾胃虚寒型IBS大鼠模型。参照文献方法[8]：具体操作:将模型组、艾灸组大鼠用绳每天将其四肢束缚1 h，限制其活动，然后将大鼠放入4 ℃冰水池中游泳15 min，1次/d，连续14 d，冰水刺激及束缚刺激同时每天下午番泻叶水煎液10 mL/kg灌胃，连续14 d。空白对照组大鼠用生理盐水灌胃(10 mL/kg/d)，不进行冰水刺激和束缚刺激。结果显示模型组、艾灸造模成功，造模过程中无大鼠死亡。

1.4 干预方法

参照《实验针灸学》[9]以及Chang Shik Yin等制定的“大鼠针灸穴位图谱”[10]对足三里和神阙穴定位。定位后在穴区剃毛。将大鼠置于艾灸固定架上后用艾条一端对准相应穴区上2 cm，将点燃艾条施灸，每穴15 min，1次/d，共14 d，记录艾灸前和艾灸后大鼠尾部温度情况[7]。空白对照组：饲喂普通饲料，不做任何处理,用KD表示；模型组：建立D-IBS模型并每日进行抓取训练和鼠衣穿脱训练，共14 d，用MX表示；艾灸组：建立D-IBS模型后每日艾灸足三里、神阙穴，共14 d，用AJ表示。

1.5 检测指标

1.5.1 AWR评分 将小儿导尿管制成的扩张球囊与注射器、压力换能器和三通阀连接，将大鼠固定在桌面上，用石蜡油润滑球囊导管后插入大鼠直肠6 cm，然后将导管束在大鼠尾端，防止滑出。待大鼠适应后用注射器向球囊内注入生理盐水，观察压力换能器连接的信号采集系统，记录大鼠出现评分为4分表现时的压力值。每只大鼠刺激 3次, 取平均值[11-12]。AWR评分标准见表1。

表1 AWR评分标准

1.5.2 5-HT、5-HAII浓度 电针干预结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后从腹主动脉中采集动脉血5 mL，离心分离血清，ELISA法检测血清中5-HT、5-HIAA浓度[13]。

1.5.3 肠黏膜超微结构取结 肠组织3块于2.5%戊二醛和锇酸固定，PBS漂洗，丙酮脱水，环氧树脂包埋，烤箱烤48 h后修块定位，切片染色，透射电镜观察结肠组织肠黏膜超微结构[14]。

1.5.4 occludin和claudin-1蛋白表达水平 取结肠组织置EP管中，加入LysisBuffer，冰浴半小时，析出蛋白后4 ℃离心，12 000 rpm，10 min，取其上清液，BCA法测蛋白浓度。配置凝胶、SDS-PAGE电泳、转膜、一抗二抗的孵育、显影、定影和剪取PVDF膜上的目的条带，用凝胶成像系统采集图像,ImageJ软件分析数据[15-16]。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，对于正态分布数据采用方差分析和t检验，非正态分布数据用中位数(四分位数间距)表示。非正态分布且方差不齐,用Kruskal-Wallis H检分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠AWR评分4分时结肠球囊扩张(CRD)压力比较

与KD比较，MX和AJ当AWR评分为4分时CRD压力值减少,差异有统计学意义(P<0.05);与MX比较，AJ的CRD压力值显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠AWR评分为4分时结肠球囊扩张(CRD)压力比较

2.2 各组大鼠血清中5-HT、5-HIAA浓度比较

与KD比较，MX、AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与MX比较，AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中5-HT、5-HIAA浓度比较

2.3 电镜各组大鼠肠粘膜结构比较

如图1所示，KD大鼠肠粘膜微绒毛长度均匀一致，排列整齐且紧密，连接完整，清晰可见，上皮细胞排列整齐且形态结构完好；MX肠粘膜微绒毛稀疏，长短不一，排列欠整齐，有少许断裂，上皮细胞结构被破坏，间质内充满高密度颗粒；AJ肠粘膜微绒毛排列较整齐，紧密连接完整，较清晰,上皮细胞形态正常，胞膜完整，间质内无高密度颗粒。

图1 各组大鼠结肠黏膜结构图(1 700×)

2.4 各组大鼠claudin-1、occludin蛋白表达比较

与KD比较，MX和AJ大鼠结肠组织中claudin-1、occludin蛋白表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与MX比较，AJ大鼠结肠中claudin-1、occludin蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 各组大鼠claudin-1、occludin蛋白表达比较

图2 各组大鼠Claudin-1、Occludin蛋白表达

3 讨论

近年来IBS是消化科门诊的常见病,《中国临床诊疗术语》确定IBS病名为“肠郁”[17]。IBS无明确的器质性病变，西医尚无明确治疗方案。研究表明[18]针灸对治疗功能性胃肠疾病有良好的疗效。中医认为其病机为心脾两虚，病理因素主要为气虚、阳虚兼有内寒、内湿和内热等[19]。情志失调多为诱因，病机为脾失健运兼心神失调。临床常见的IBS症型有：脾胃虚寒、肝气脾虚、肝郁气滞、脾胃湿热和寒热错杂等。其中脾胃虚寒证较为多见，多由贪凉饮冷所致。治疗上宜健脾胃为主，调心神为辅。临床上中医外治法治疗IBS方法众多,而辨证论治是针灸治疗疾病的基础[20]，故本次实验选用足三里、神阙穴施灸，可改善患者脾胃虚寒引起的症状，恢复脾胃的运化功能，增强机体免疫力，对治疗脾胃虚寒型IBS有显著疗效。足三里乃胃之下合穴，“肚腹三里留”，足三里固护脾胃化生的后天之气。神阙穴可培元固本、和胃理肠。灸之可显著改善患者阳虚症状，研究表明[21-22]艾灸治疗IBS疗效确切,对改善机体免疫力、增强机体抗病能力有一定作用。

肠粘膜的机械屏障是由肠上皮细胞和细胞之间的黏连蛋白构成[23]。肠粘膜上有大量的黏连蛋白。其中Occludin、Claudin-1是非常重要的紧密连接蛋白[24]。Occludin能调节和维持肠道通透性，参与细胞内信号传递。当Claudin-1表达异常时会导致组织渗透性改变而引起水钠代谢失衡，从而引起腹泻。当致病因素侵袭时，肠粘膜的紧密连接蛋白会遭到破坏，肠道通透性增加，而肠道通透性改变又是内脏高敏感性的重要原因之一，肠道高敏感性和肠道动力障碍可引起腹痛、腹胀。当致病因素侵袭机体时，机体免疫系统启动应激机制，肥大细胞会释放大量5-HT，5-HT参与中枢神经系统与胃肠道系统之间的信号传递[25]，释放后的5-HT会与肠粘膜上的5-HT受体结合，使胃肠动力发生异常改变，从而加重腹痛、腹泻。5-HIAA是5-HT被肥大细胞内的单胺氧化酶(MAO)降解的产物，5-HIAA的浓度可以反映5-HT在肥大细胞内的代谢情况[26]。故5-HT、5-HIAA浓度的变化可以反应肠粘膜上免疫系统的活性。而机体的免疫功能是由机械屏障和免疫屏障共同构成，二者之间相互影响。

此次研究发现IBS患者肠粘膜处于旺盛分泌和高度活跃的状态，其肠粘膜超微结构发生很大的改变，艾灸可促进IBS患者肠粘膜的修复，维持神经-免疫-内分泌系统的正常运转，减轻临床症状。