徐芳媛 ，罗来 ，许金森 ，潘晓华 ，黄倩茹 ，万隆 ，朱佳敏

1 福建中医药大学针灸学院 福建福州 350108

2 福建省中医药科学院 福建福州 350003

3 福建省经络感传重点实验室 福建福州 350003

脑卒中是神经系统中最为常见和多发的疾病，而在脑卒中患者中，发病3个月内的大多以肢体功能障碍为主要表现[1]，因此对患者的的日常生活和生存质量造成了巨大的影响。针灸治疗脑卒中的水平已经日趋成熟，电针已经成为针灸临床中广泛应用的医疗器材[2]。运用电针治疗是脑卒中的一个重要治疗手段，在既往的研究中也取得了良好的效果[3]。γ-神经突触核蛋白（SNCG）主要分布在大脑的突触前末端和周围神经系统，它是具有高保守性和低分子量的可溶性蛋白[4]。SNCG在胚胎和新生儿脑组织中不表达，但会随着年龄的增长而不断增加，而三叉神经节在胚胎发育的10～11d后终止并逐渐成熟[5]。在神经系统中，它可能参与突触功能和可塑性的调节，并且与神经生长和神经网络的稳定性有关[6]。因此，本研究通过观察电针对大脑中动脉闭塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的脑卒中症状的影响，和缺血侧海马中SNCG 蛋白含量变化来探讨电针治疗脑卒中的机制，为电针治疗脑卒中提供理论依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物 选用成年的SD雄性大鼠共18只，均由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，体质量（300±20）g，大鼠等级：清洁级。每笼6只大鼠，均自由进食及饮水，适应性饲养1周。饲养条件：温度（22±2）℃，湿度（55±15）%，12h明暗交替，自由进食与饮水。实验过程中均严格按照国际动物保护及使用指南的规定进行。

1.2 主要实验器械与试剂 华佗牌30号0.5寸不锈钢毫针（中国上海） 、SDZ-II型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）、小动物呼吸麻醉系统（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800号大鼠用MCAO线栓（广州佳灵生物技术有限公司）、洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）、ViiA 7 Realtime PCR System 荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、酶标仪（Thermo）、2X PCR master mix试剂盒（Arraystar）、Primer试剂盒（英骏生物技术有限公司）、细胞及组织总蛋白抽提试剂盒（KangChen，KC-415）、BCA 蛋白质定量试剂盒（KangChen，KC-430）。

2 分组与造模

将18只大鼠按随机数字表法随机均分为电针组、模型组、假手术组。电针组和模型组参考Longa改良线栓法[7]，在大鼠左侧行MCAO手术，具体操作方法为[8]：①大鼠术前禁食不禁水12 h；②将大鼠投入透明麻醉诱导盒中，开启异氟烷流量并调至500 ml/min，浓度调至5 %，持续1min，待大鼠呼吸平稳缓慢，缩爪反射消失后，将大鼠取出戴上呼吸面罩，并根据术中大鼠对手术刺激的反应，适当调节浓度、流量以维持麻醉深度；③将麻醉后大鼠四肢固定仰卧于手术板上，剔除左侧颈部毛发，用酒精对暴露皮肤进行消毒，于颈部前正中线切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）；④使用缝合线在左侧ECA的远心端打一个死结，结扎ECA，继而使用动脉夹夹闭ICA、ECA的远心端；双极电凝器电凝ECA的1个分支，避免在剪断时失血；在ECA距CCA的分叉1 cm处剪开1个小口，将线栓缓慢沿ECA插入ICA，在剪口处向下约2 mm处使用缝合线打一活结略微绑紧ECA，之后剪断ECA并将残端反折以使线栓插入ICA，遇到轻微阻力时即停止插入，进线深度为18～22 mm，再将ECA残端的活结打死防止线栓脱出；⑤缝和伤口并消毒，2 h后轻柔回抽线栓至CCA分叉处，减去线栓的体外部分，实现再灌注损伤；⑥假手术组只将颈部皮肤剪开，钝性分离CCA、ICA、ECA后即缝合，不予结扎和插线；⑦保持室温为25℃左右，直至大鼠苏醒。

3 动物造模后筛选

再灌注 2h，大鼠完全苏醒后，对所有大鼠进行提尾实验[9]。将大鼠尾巴提起后，右前肢屈曲，表明造模成功，进入下一阶段实验；若大鼠能够正常活动、进食，或不能自发行走意识朦胧或丧失则为造模失败，退出实验。

4 干预措施

电针组参考《实验针灸学》[10]选取大鼠“神庭”“百会”穴，选用华佗牌30号0.5寸不锈钢毫针沿头部向上斜刺0.2～0.3 cm，连接SDZ-II电针仪，以针体轻微抖动且大鼠耐受为度，选取疏密波，频率为2～10 Hz，每次干预时间为20 min，于大鼠术后24 h开始进行干预，连续7日。模型组和假手术组行同等条件抓取后回笼，不予治疗。

5 标本采集与检测

5.1 平衡木实验 在手术后第1，3，7天对3组大鼠进行平衡木实验，判断神经损伤情况[11]。将大鼠放置在1根宽1.5cm、长30cm、高于地面30cm的木条上，观察它们的行为表现。实验前1周对各组大鼠进行训练：每日8点和17点各训练1次，每次10 min，以大鼠能顺利在平横木上保持稳定为标准。造模成功后分别在第1，3，7天对每组大鼠进行平衡木实验并评分[12]，评分为0～6分，0分：大鼠在平衡木上能够保持平衡稳定；1分：大鼠在平衡木上需要抓紧平衡木边缘才能保持平衡稳定；2分：大鼠需抓紧平衡木但是同时有一只脚落下才能保持平衡稳定；3分：大鼠需要抓紧平衡木但是同时有两只脚落下，或在平衡木上旋转，能够坚持在平衡木上的时间≥60s；4分：大鼠试图在平衡木上保持平衡，但落下，同时能够坚持在平衡木上的时间≥40s；5分：大鼠试图在平衡木上保持平衡，但落下，同时能够坚持在平衡木上的时间≥20s；6分：落下，没有试图保持平衡或抓住平衡木，能够坚持在平衡木上的时间≤20s。评分越高神经损伤越严重。

5.2 q-PCR检测脑组织SNCG mRNA表达 实验结束后，取出大鼠左侧海马，放入RNA的保存液中，继而放入-80 ℃冰箱里面备用。参照Trizol一步法说明提取总RNA[13]，具体步骤为：①每50～100mg组织样品，加入1ml的Trizol试剂，用电动匀浆器进行匀浆；②每1ml的Trizol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，离心15min；③离心后将水相转移到新离心管中，水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀沉淀后于离心10min；④移去上清液，加入75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，离心5min；⑤去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10min；⑥溶解RNA，获得的RNA溶液保存于-70°C；⑦配制退火混合物；⑧短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液；⑨移液枪轻轻吸打几次混合均匀，50℃温育60min，70℃ 温育15min使酶失活，cDNA置冰浴待用或-20℃保存。引物序列见表1。q-PCR反应体系：反应总体积10 μL，其中上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，qPCRmaster-Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反应条件：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒（收集荧光））。每个标本均设复孔，重复3次，获得SNCG mRNA基因Ct值，以GAPDH为内参，按照2-△△Ct方法处理数据。其中，△Ct=（目的基因平均Ct-内参平均Ct）；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct），所有数据均与内参比较。

5.3 免疫蛋白印记（WB）检测脑组织中SNCG的蛋白的表达 制备蛋白样品[14]，具体步骤为：①将细胞提前种植在6cm平皿中，待细胞长至70%～80%时取用，加入2mlPBS洗涤2遍，彻底吸净PBS残液；②加入细胞裂解液 150μl，将细胞刮下，放在冰上裂解20min，然后将裂解液移至EP管中，离心20min；③将上清液移入新的EP管中，即为所需蛋白样品；④运用 Bradford 法测定蛋白样品的浓度；⑤向其余蛋白样品中加入其1/4体积的5X上样缓冲液，混匀，煮沸10min，存于-20℃待用。蛋白质电泳的具体步骤为：①配胶：配制8%的下层胶和6%的上层胶；②上样电泳：每个蛋白泳道上样量10μl，电泳时间为45min，恒定电流25m；③转膜：电泳完成后将蛋白质转移到NC膜上，转膜时间为45min，电压恒定20V；④立春红染色证实转膜情况，标记标准蛋白分子量所在位置，去离子水洗 2 遍；⑤PBST 配制的 5%的脱脂牛奶室温封闭1h；⑥PBST 配制 2.5%脱脂牛奶稀释一抗（1：500）封闭条带置于摇床，4℃冰箱过夜；⑦PBST洗3min×5次；⑧PBST 配制 2.5%脱脂牛奶稀释辣根酶标记的二抗（1：2000），室温封闭 1h，PBST 洗 3min×5次；⑨ ECL 显影。

6 数据处理

结 果

1 平衡木实验评分

造模手术24 h后，电针组的平衡木实验评分高于假手术组（P=0.002），模型组的平衡木实验评分高于假手术组（P=0.002），电针组和模型组之间无明显差异（P＞0.05）；术后3d电针组评分和假手术组存在差异（P=0.009），但电针组低于模型组评分（P=0.009），模型组评分高于假手术组（P=0.001）；术后7 d后电针组评分高于假手术组，两者之间存在差异（P=0.035），电针组明显低于模型组（P=0.003），模型组评分高于假手术组（P=0.001），3组之间存在明显差异，见表2。

表1 引物序列

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较（）

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较（）

组别 例数 术后1d 术后3d 术后7d电针组 6 5.11±0.54 3.23±0.51 2.23±0.42模型组 6 5.23±0.69 5.89±0.76 5.92±0.02假手术组 6 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00

2 SNCG在海马中的表达

电针组较假手术组而言，SNCG mRNA表达量明显升高（P=0.027）；模型组较假手术组而言，SNCG mRNA表达量明显降低（P=0.023），电针组和模型组之间存在明显差异（P=0.004），见表3。

表3 3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达（）

表3 3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达（）

组别 只数 SNCG mRNA电针组 6 0.05±0.003模型组 6 0.01±0.009假手术组 6 0.03±0.003

3 Western blot 检测 SNCG在脑组织中蛋白的表达

电针组较假手术组而言，SNCG 蛋白的表达量无明显差异（P=0.213）；模型组较假手术组而言，SNCG蛋白的表达量明显降低（P=0.002），电针组和模型组之间存在明显差异（P=0.007），见表4。

表4 3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达（）

表4 3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达（）

组别 只数 SNCG mRNA电针组 6 0.90±0.005模型组 6 0.71±0.008假手术组 6 0.96±0.009

讨 论

运动功能障碍是脑卒中的主要并发症，脑卒中患者出现运动障碍以及神经障碍等症状的概率为80%[15]。脑卒中对患者的正常生活与工作均造成不同程度的影响，并且在疾病不断的发展过程中，导致患者出现偏瘫的病症，甚至导致患者的死亡[16]，因此，脑卒中疾病的危险性与死亡率较高。

平衡木实验是较为经典的检测神经功能缺损的指标，可以直观的反应大鼠大脑与肢体当前的协调配合控制能力[17]。本研究结果显示，对脑卒中大鼠进行电针“神庭”“百会”6周的治疗后，其平衡木实验评分较模型组有明显的改善，并且3组之间存在统计学差异，可以认为电针神庭、百会对于MCAO大鼠的神经功能缺损有明显的改善作用。

近年来，功能基因组学技术已经广泛运用于动植物生理生化、肿瘤与干细胞、脑及中医药研究等领域，并促进了相关领域的发展[18-19]。全转录组测序和蛋白组测序分析结果显示，SNCG mRNA及其编码的神经核蛋白-γ在假手术组中均为低表达，在模型组显著上调，电针显著抑制其高表达量，SNCG mRNA及其编码的神经核蛋白-γ在3组动物中的表达趋势一致，表现为在转录水平的有效调节[20]。

通过比较3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达量，可以发现电针组较假手术组有明显的升高，而模型组较假手术组有明显的降低。研究发现MCAO大鼠海马中SNCG的表达量比假手术组要低，而通过电针治疗后，SNCG会明显的升高，可以认为SNCG与大鼠认知功能之间存在关系。

通过比较3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达量，可以发现电针组较模型组有明显上升，模型组较假手术组有明显的降低。研究表明MCAO大鼠海马中SNCG蛋白的表达量比假手术组要低，而通过电针治疗后，SNCG的蛋白表达会明显的升高，可以认为SNCG蛋白表达量与大鼠的认知功能之间存在联系。

在既往的研究中，已经有大量实验论证了SNCG对肿瘤细胞之间存在关联性，却极少文章有提到与脑卒中的联系[21]。SNCG在胚胎和新生儿脑组织中不表达，但会随着年龄的增长而不断增加，而随着它的增长，我们的脑功能不断健全完善，使我们从婴幼儿成长为脑功能健全的成年人，而随着年龄的增加，SNCG在不断的减少，导致脑卒中在中老年群体中发病最明显。在本次实验中，经过电针干预后，电针组大鼠海马中SNCG mRNA的表达较假手术组明显升高，模型组大鼠海马中SNCG mRNA的表达较假手术组明显降低。结合本实验大鼠神经功能评分结果，我们认为造模后大鼠海马组织中SNCG mRNA的表达降低通过某种途径促使神经功能评分升高，电针干预后促进了SNCG mRNA的表达，增加了SNCG的释放，降低神经功能评价，达到治疗的目的，因此SNCG可能是治疗血管性认知障碍的潜在靶点之一。经过电针干预后，电针组大鼠海马中SNCG对比的表达较模型组明显升高，模型组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达较假手术组明显降低。进一步论证了电针能有效提高SNCG蛋白的表达，深入明确了SNCG与血管性认知障碍之间的联系，但由于脑卒中病理机制的复杂性和电针干预效果的多靶点特征，对于电针改善脑卒中症状的机制还有待进一步研究。