吴晓敏，陈映雪，周星宇，张 俊，黎 莹，李 欣，张笑菲，陈士岭

南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心，广东 广州510515

在全球范围内，促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-ant）方案已经成为辅助生殖治疗最常用的控制性促排卵方案之一，GnRH-ant方案疗程简化，治疗时间短，明显降低卵巢过度刺激综合征的风险［1］，对垂体抑制程度减轻，停药后卵巢功能恢复迅速，因此被广泛地应用于高龄人群与卵巢储备减退（DOR）患者。

高龄DOR群体周期取消率高，妊娠率低［2］，DOR是一个渐进性发展的过程，促卵泡刺激素（FSH）的升高早于黄体生成素（LH）的变化［3］，导致基础FSH/LH的比值升高。已有研究表明，≥35岁的DOR患者，LH/FSH与卵母细胞数量正相关，加之使用GnRH-ant后内源性LH被抑制，预测卵巢反应性较差，提示可以考虑通过给予HMG，提高LH与FSH的比例，以降低刺激不良风险［4］。有证据显示GnRH-ant方案中添加HMG可以显著提高胚胎种植率和临床妊娠率［5］，亦有相反的观点认为患者应用GnRH-ant后的内源性LH仍足以维持对卵泡发育的刺激作用，需要重新评估添加的必要性［6-7］，目前对GnRH-ant方案中添加HMG的研究较少且结论各异，国内对于特定高龄DOR群体的应用缺乏文献报道，需要进一步探索。

本研究旨在分析应用GnRH-ant方案过程中，高龄DOR患者添加HMG是否受益以及HMG添加时机对妊娠结局的影响，以探求更好的用药方案，为提高高龄DOR群体临床促排卵治疗的有效性提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

回顾性分析2014年1月～2019年12月于本中心采用GnRH-ant方案行常规体外受精/卵胞浆单精子显微注射受精（IVF/ICSI）助孕的高龄DOR患者，纳入标准：年龄≥35岁，且满足以下2项标准中的任意一项：（1）双侧卵巢基础窦状卵泡数（AFC）≤5；（2）基础FSH≥10 U/L，和（或）基础FSH/LH＞3.6。

1.2 促排卵方案及分组

所有患者均采用GnRH-ant方案，于月经周期第2-4天评估卵巢基础状态，给予FSH制剂（注射用重组人促卵泡素，默克雪兰诺；重组促卵泡素β注射液，默沙东；注射用尿促卵泡素，丽珠）150～300 U/d启动促排卵治疗，根据HMG（注射用尿促性素，丽珠）的添加时机，共分为3组。无添加组：不添加HMG，仅使用FSH至扳机日；早期添加组：Gn第1日开始每日添加HMG 75～150 U至扳机日；中晚期添加组：主导卵泡直径约10～14 mm时每日添加HMG 75～150 U至扳机日，同时减少相应FSH剂量。Gn使用第5或6日时皮下注射GnRH-ant 0.25 mg/d直至扳机日，当2～3个优势卵泡直径≥18 mm时给予HCG 5000～10 000 U或联合促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）0.2 mg扳机，诱发排卵36～38 h后行经阴道超声引导下取卵术，取卵日开始黄体支持。

1.3 胚胎培养及孕期监测

根据男方精液质量及患者病情决定行IVF或ICSI，取卵后第3天或第5天行新鲜胚胎移植，若患者不适合鲜胚移植（因内膜因素、孕酮升高等）则行全胚冷冻。移植12 d后检测血β-绒毛膜促性腺激素水平，移植后4周通过超声观察到一个或多个孕囊及胎儿心管搏动确定为临床妊娠。优质胚胎标准为2PN来源、卵裂球数目7～8个且评分Ⅰ、Ⅱ级（Edwards标准）的D3胚胎［8］或评分≥3BB的囊胚（Gardner评分法）。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验；计数资料用率表示，采用χ2检验。P＜0.05（双侧）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基础情况比较

本研究共纳入682例≥35岁的DOR患者，其中无添加组371例，早期添加HMG组139例，中晚期添加HMG组172例。3组患者女方年龄、不孕年限、体质量指数（BMI）、原发不孕比例、继发不孕比例、基础FSH、LH、E2、P、AFC、AMH差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 患者基础情况比较Tab.1 Baseline characteristics of the patients

2.2 卵巢刺激情况和促排卵结局

3组扳机日LH、E2、P水平、扳机日子宫内膜厚度、扳机日直径≥14 mm、≥16 mm、≥18 mm的卵泡个数、受精率、卵裂率、优质胚胎数差异均无统计学意义（P＞0.05）；早期添加组、中晚期添加组Gn用量高于无添加组，中晚期添加组获卵数高于早期添加组，中晚期添加组成熟卵子数、可利用胚胎数均高于无添加组及早期添加组（P＜0.05，表2）。

表2 卵巢刺激情况及促排卵结局Tab.2 Outcomes of controlled ovarian hyperstimulation in the patients

2.3 新鲜移植周期妊娠结局

3组间新鲜周期种植率、早期流产率、异位妊娠率、活产率比较均无统计学差异（P＞0.05）。中晚期添加组临床妊娠率高于无添加组（P＜0.05），但早期添加组与无添加组及中晚期添加组比较均无统计学差异（P＞0.05，表3）。

表3 新鲜移植周期妊娠结局Tab.3 Clinical outcomes of fresh embryo transfer cycle

2.4 全胚冷冻周期首次冻融胚胎移植（FET）妊娠结局

中晚期添加组临床妊娠率较早期与无添加组妊娠率稍高，但未达到统计学差异，3组间种植率、早期流产率、异位妊娠率、活产率比较均无显著性差异（P＞0.05，表4）。

3 讨论

本研究资料显示，中晚期添加组的成熟卵子数、可用胚胎数、新鲜周期临床妊娠率明显升高，提示GnRHant方案中中晚期添加HMG能改善高龄DOR人群的促排卵结局和新鲜周期临床妊娠率。此外，无添加组扳机日的LH水平为4.52±5.18 IU/L，与早期和中晚期添加组相比无显著差异，表明添加HMG后不影响血清LH水平，不能够通过血清LH水平反应添加HMG后的LH水平。

HMG是外源性LH制剂的一种，是从绝经期妇女尿中提取的促性腺激素（Gn），含FSH∶LH 比例1∶1，HMG中LH的活性主要由hCG驱动［9］，与LH相比，hCG半衰期更长［10］，与黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）亲和性更高［11］，其分泌不受性激素反馈调节机制的影响，能够为卵泡生长提供更稳定的刺激环境。

表4 全胚冷冻周期首次FET妊娠结局Tab.4 Clinical outcomes of the first frozen-thawed embryo transfer cycle with a"freeze-all"strategy

女性35岁以后LH的生物活性下降［12］，使用GnRHant会导致卵泡液中LH、AMH水平显着降低，而AMH与卵母细胞的着床潜力正相关，补充HMG能诱导卵泡分泌雄激素，刺激AMH分泌，改善卵母细胞质量［13］，对于高龄DOR患者，推测添加HMG能增加IVF成功率［14-15］。有学者观察到，高龄患者添加rLH与单用rFSH相比，获卵数、种植率、流产率等均无差异，并无额外益处［16-18］。Alviggi［19］则提出，补充外源性LH制剂可能对两类患者有利，包括预期对卵巢刺激反应较迟钝者以及36～39岁者，与本文研究结果一致。既往研究多集中于长方案以及rLH添加与否对妊娠结局的影响，本文根据添加时机进行分组，首次明确阐述了GnRH-ant方案中高龄DOR患者中晚期添加HMG可获益。

本研究中，与中晚期添加组相比，早期添加组的患者扳机后获卵数偏少，差异有统计学意义。根据LH窗［20］和LH ceiling学说［21］，甾体激素的合成及优势卵泡的继续生长需要在合适的LH作用水平下，即达到LH阈值，但不能超过一定的LH范围，过低或过高均不利于卵泡发育。不同发育阶段的卵泡LH上限不同，与未成熟卵泡相比，成熟卵泡的LH上限更高。考虑早期添加组获卵数下降可能是由于GnRH-ant方案允许内源性LH的早期作用，再添加HMG会使得LH活性超过上限值，早卵泡期，未成熟卵泡耐受性较低，LH活性过高，将会抑制颗粒细胞增殖，造成过早黄素化或卵泡闭锁［22］。一方面，颗粒细胞功能丧失和过早黄素化，会导致许多与卵母细胞发育有关的细胞因子如抑制素、胰岛素样生长因子等合成受阻，干扰卵丘-卵母细胞复合体的成熟过程［23］；另一方面，获卵数的减少造成最终可利用的胚胎数少，这可能是早期添加组成熟卵子数、可利用胚胎数均低于晚期添加组的原因。

生理状态下，卵泡早期，FSH刺激卵泡募集，使小窦状卵泡免于凋亡。卵泡中期，血液中升高的E2通过负反馈机制抑制FSH，但被选择的优势卵泡依然可以进一步发育生长，很大程度上是由于卵泡逐渐依赖于LH［24］，该阶段颗粒细胞开始表达自身LHCG受体并能直接对LH产生应答，同时卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞产生的卵泡内调节因子使得颗粒细胞对FSH敏感性降低，LH的作用日益增大。高龄DOR患者处于生殖功能的老化阶段，颗粒细胞有丝分裂速度减慢，凋亡比例增高［25］，LHCG受体敏感性下降。在卵泡中后期，当生长的卵泡处于对类固醇生物合成刺激和最终成熟的最大需求时，内源性LH水平快速下降，可能会对卵子正常发育造成不利影响［26］。此时添加HMG符合生理需求，中晚期添加HMG能上调FSHR和LHR的表达，增加芳香化酶的活性，增加颗粒细胞对FSH的敏感性［27-28］，刺激雄激素-AMH轴，从而改善卵子发育能力，提高胚胎质量［29］。因此无添加组及中晚期添加组在获卵数上虽无差异，但在成熟卵子数及可利用胚胎数上中晚期添加组明显更高，这与国内外学者研究一致，卵泡中后期添加HMG可以弥补内源性LH活性不足带来的负面影响，促进卵母细胞发育成熟［30-31］。

研究中观察到，中晚期添加组鲜胚移植周期临床妊娠率明显高于无添加组，除了由于中晚期添加HMG促进卵子发育成熟，子宫内膜上存在LHCG受体［32］，研究证实，HMG中的hCG成分对蜕膜化、着床、血管生成等过程具有重要的旁分泌作用［33-34］，hCG可以直接作用于内膜调节蜕膜代谢，诱导基底层成纤维细胞中与蜕膜化相关的α-平滑肌细胞肌动蛋白合成，调节血管内皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子结合蛋白1等的表达，同时保护内膜基质细胞免于氧化应激相关的凋亡［35］。此外，当子宫内膜过早或过久暴露于hCG作用时，会触发LHCG受体下调和下游信号减敏，细胞外信号调节激酶1/2磷酸化消除，内膜细胞的粘附能力和紧密连接调节受损，继而影响妊娠率，与Evans等的研究一致［36］，中晚期适量添加HMG能改善内膜容受性，但过早添加反而削弱hCG的生物学作用，这可能是早期添加组临床妊娠率高于无添加组，而低于中晚期添加组的原因。3组中，中晚期添加组活产率仍最高，比无添加组高9.5%，但差异无统计学意义，考虑与中晚期添加组样本量较少有关，有待扩大样本量进一步研究。

新鲜移植周期中晚期添加组临床妊娠率高于无添加组，而在全胚冷冻周期两组差异在统计学上不显著，推测可能原因是卵巢刺激周期中，中晚期添加HMG能改善子宫内膜的接受能力，促进内膜血管化，而冻胚移植可能消除了HMG 对内膜的积极作用。Andersen等［37］的研究也表明，促排卵过程使用HMG会使血清和卵泡产生不同的激素水平波动，继而影响内分泌反应和子宫内膜接受性。

本研究中，早期添加组与中晚期添加组Gn使用量均高于无添加组，可能是由于HMG含有较多的尿蛋白杂质，制剂批次间差异较大，其生物活性存在内变异，不如通过基因工程单克隆技术合成的FSH制剂纯度高，生物活性和均一性好。但国产的HMG 价格仅为进口rFSH的1/9，仍然不失为是一种经济有效的促排卵药物选择。

综上所述，应用GnRH-ant 方案时，中晚期添加HMG促进卵泡发育，可能可以提高子宫内膜的容受性，有利于改善高龄DOR患者的新鲜周期临床妊娠率。本研究为回顾性研究，有待于严谨的前瞻性随机对照试验进一步分析，在药代动力学和分子水平上对其调控机制进行验证。