一种混合模式反相/阴离子交换色谱固定相的制备与评价

2021-04-13刘会娟杨丙成

化学研究 2021年1期

刘会娟，杨丙成

(华东理工大学药学院，上海 200237)

反相液相色谱(reversed phase liquid chromato-graphy, RPLC)是发展最早、应用最广泛的色谱技术之一，主要应用于非极性和弱极性样品的分离[1-2]。自从1970年KIRKLAND等[3]首次制备出反相模式固定相以来，反相模式固定相已经成为应用最广泛的液相色谱分离模式，其固定相研究也不断有新的突破。反相模式固定相多以硅胶或改性硅胶为基质，在其表面键合疏水性功能基团来实现对疏水样品的保留。典型反相模式固定相仍存在如下不足：1) 非特异性吸附。硅胶表面存在丰富的硅羟基，表面键合反应仅能利用一部分硅羟基，残余的游离硅羟基易发生电离而呈现负电荷，当流动相pH ≥4时，带负电荷的硅羟基易于吸附解离的碱性样品(二者存在静电作用)，从而造成碱性样品的柱效降低、峰拖尾、分离度降低等不利影响[4]。解决此缺陷的主要措施是利用封尾技术尽量减少残留硅羟基的数量[5]；2) 不能承受较高比例的水相。烷基在纯水或高比例水相中会出现碳链缠绕而造成固定相分离能力的缺失。目前已有对传统硅胶进行改性[6-7]，内嵌极性基团屏蔽样品与硅羟基的接触[8-12]等方案。

在药物研究领域，碱性药物的比例高达75%，目前分离分析碱性化合物最常用的手段仍然是RPLC，而RPLC固定相中硅胶基质又占据主要地位。尽管随着技术的发展进步，逐渐发展出高纯度的杂化硅胶，但是残余硅羟基带来的次级效应依然是导致碱性化合物分析中出现峰形拖尾、载样量低、死吸附等难题的主要原因。因此寻求可以有效屏蔽硅羟基影响、提高耐水能力的解决方案一直是色谱固定相的研究重点。

采用同时键合含环氧基团的硅烷化试剂和十八烷基硅烷混合试剂，再利用小分子叔胺对环氧基进行开环，制备出表面含有季胺基的混合模式固定相。考察电荷屏蔽效应对碱性样品拖尾的效果，并对其进行了表征、机理考察和分离应用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：RCT安全可控磁力搅拌器购于IKA仪器设备有限公司(德国)；QL-861型震荡混合器(海门，中国)；SB-5200 DTDN型超声清洗器购于新芝生物有限公司(宁波，中国)；电热鼓风干燥箱购于一恒科学仪器有限公司(上海，中国)；色谱柱装柱机购于思谱精工(大连，中国)；FE20型pH计购自梅特勒-托利多仪器有限公司(上海，中国)；Malvern Zetasizer电位仪(型号Nano ZS90)；实验用水来自Milli-Q纯水系统。

试剂：球形硅胶(5 μm, 10 nm, 300 m2/g)购于华谱科技有限公司(浙江，中国)；HPLC级乙腈、甲醇购自Tedia(USA)；甲酸铵、甲酸购自Acros(USA)；十八烷基三甲氧基硅烷(Octadecyltrimethoxysilane,ODS)购于百灵威(北京，中国)；3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTES)购于阿拉丁(上海，中国)；N,N-二甲基甲酰胺、分析纯甲苯、三甲胺(trimethylamine, TMA)均购自凌峰化学试剂公司(上海，中国)；多环芳烃、小分子碱、核苷碱基、有机酸、药品等分析物购自Sigma。

1.2 固定相的制备

固定相的制备路线如图1所示，具体操作如下：

1) 硅胶活化：称取3 g硅胶，超声分散在100 mL 3 mol/L HCl水溶液中。105 ℃下回流加热6 h，磁力搅拌(250 r/min)。活化结束后冷却至室温，用4#砂芯漏斗抽滤，去离子水洗涤数次至滤液呈中性，60 ℃过夜烘干，密封保存备用。

2) Sil-ODS/GPTES的制备：以甲苯(30 mL)作为反应溶剂，在100 mL圆底烧瓶中加入已活化硅胶3 g，9.43 mL ODS(20 mmol)，0.46 mL GPTES(2 mmol)，在氮气氛围下，110 ℃，250 r/min，加热回流反应24 h。反应结束后用4#砂芯漏斗抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇洗涤数次，60 ℃过夜烘干待用。

3) 环氧开环反应：以N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)作为反应溶剂，在100 mL圆底烧瓶中加入3 g Sil-ODS/GPTES，0.86 mL三甲胺(4 mmol)，60 ℃，250 r/min，加热反应1 h。反应结束后用4#砂芯漏斗抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇洗涤数次，60 ℃烘干。

图1 固定相合成路线Fig.1 Synthesis route of the stationary phase

1.3 色谱柱装填、液相色谱系统

采用高压匀浆法装填色谱柱，具体操作如下：称取2.0 g固定相溶解于20 mL甲醇，超声30秒充分混合后迅速倒入匀浆罐内，接上不锈钢柱管(150 mm length×4.6 mm i.d.)后，以甲醇作为顶替液，34.475 MPa (5 000 psi)恒压装柱30 min，装柱结束后泄压30 min。填充结束的色谱柱以甲醇为流动相，在0.2 mL/min的流速下冲洗过夜。

色谱评价系统：Acchrom S3000高效液相色谱仪(华谱，中国)。

2 结果与讨论

2.1 固定相的结构表征

硅胶和所得固定相的元素分析结果如表1所示。根据所得固定相(C18/TMA)的N含量，其表观交换容量为93mol/g，表明TMA成功键合于硅胶表面；对比裸硅胶与C18/TMA的红外谱图(如图2左)，C18/TMA固定相在2 860和2 930 cm-1的吸收峰可对应于烷基的伸缩振动峰；为验证固定相表面季胺基团的存在，对其进行了表面电势(ζ电位)测定(如图2右)。裸硅胶在pH 2～7的范围内均呈负电势，而C18/TMA在此pH范围内电位值均呈正电势，即证明了季胺基团的存在。

表1 固定相元素分析结果

图2 裸硅胶和C18/TMA的红外光谱分析(左)和ζ电位分析(右)Fig.2 Characterization of FT-IR and ζ measurment of bare silica and C18/TMA stationary phase

2.2 反相模式分离

C18/TMA固定相键合了十八烷基疏水长链，可以提供疏水作用位点，用来分离多种非极性样品。选择甲苯、丙苯、丁苯、戊苯、2-甲基萘、菲、苯并菲等七种非极性物质作为目标样品，分离效果如图3(a)所示。七种样品均实现了基线分离，其中戊苯的理论塔板数为61 346块/m，出峰顺序与分析物的非极性大小顺序一致，符合疏水作用保留特点。

传统C18固定相分离小分子碱，通常需要在流动相中加入缓冲盐来减弱碱性样品与硅羟基的静电作用，但缓冲盐的加入不利于色谱柱和仪器的使用寿命，尤其是当和质谱联用时尤为明显。为了考察C18/TMA固定相中季胺基对硅羟基的屏蔽作用，选择二羟丙茶碱、茶碱、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺四种小分子碱作为分析物，尝试在流动相中不添加缓冲盐的情况下，考察小分子碱的分离情况。实验结果如图3(b)所示，四种物质达到基线分离，峰形对称性良好，不对称因子在1.2左右，证明了季胺基团的静电屏蔽作用可以在一定程度上屏蔽硅羟基，色谱峰拖尾现象得到明显改善。

2.3 亲水作用模式分离

C18/TMA含有季胺基团，可以提供离子交换位点，理论上可应用于阴离子及可解离的极性样品的分离。而芳香酸类物质含有苯环非极性基团，为考察两种键合基团对芳香酸保留的影响，选择5种芳香酸进行分离，结果如图4(a)所示。5种有机酸可达到基线分离，分离度在2.3以上，其中3,5-二硝基苯甲酸的理论塔板数达到73 359块/m。流动相中缓冲盐的pH为6.01，5种芳香酸的pKa均低于该pH，在此流动相条件下均处于解离状态，多以离子形式存在，与固定相上的季胺基团存在离子交换作用。为考察固定相在亲水模式下对强极性样品的保留情况，选择5种核苷碱基作为目标物进行实验，保留效果如图4(b)所示，在等度洗脱模式下，5种样品在10 min内达到基线分离，以胞嘧啶的色谱峰进行计算得到理论塔板数为54 560块/m，说明键合的季胺基团可以提供极性作用位点，可用于亲水模式下分离极性样品，且具有较高柱效。

2.4 色谱保留机理考察

在反相色谱模式下，水是弱洗脱溶剂，水含量对非极性物质的保留行为影响较大。以多环芳烃为分析物，通过改变流动相中的水含量考察了所得固定相的保留机理(结果如图5所示)。在水含量比例范围为20%～40%，随着流动相中水含量的增加，所有样品的保留均增加，符合典型疏水保留机理。

2.5 去湿现象考察

正如前文提到的，反相模式固定相在有机相比例过低，甚至是100%水相时，功能性的碳链会出现严重的“相塌陷”，又被称为固定相“去湿”[13]。具体评价方法是：使用纯水流动相时，在停止流速一段时间，再次恢复后样品保留会损失，即样品的保留时间不可重现。本文所得固定相结构中内嵌有羟基、醚键、季胺基等极性基团，理论上固定相的亲水性相较于纯烷基C18固定相有明显的增强。为验证其去湿性能，采用Stop-flow进行测试，具体操作如下：先用甲醇对色谱柱进行50倍柱体积的冲洗，接着用50 mmol/L的NH4FA冲洗50倍柱体积，待纯水完全替代甲醇后，平衡进样进行数据采集，采集结束后，流速降为0，色谱柱在此水环境下浸泡30 min，30 min后进入下一轮平衡，重复之前的操作并进样采集数据，测试结果如图6所示，两种分析物的保留时间在两次采集中无明显变化，表明该固定相具有较好的去湿性能。

条件: 流动相，(a) MeOH/H2O: 70/30(体积比)；(b) MeOH/H2O: 60/40(体积比)；紫外检测波长，254 nm；柱温，30 ℃；流速，1 mL/min；进样量，20 μL；分析物，1，甲苯；2，丙苯；3，2-甲基萘；4，丁苯；5，菲；6，戊苯；7，苯并菲；8，二羟丙茶碱；9，茶碱；10，3-硝基苯胺；11，2-硝基苯胺图3 非极性物质(a)与小分子碱(b)的分离Fig.3 Separation of non-polar analytes (a) and organic base (b) by C18/TMA

条件: 流动相,(a)MeOH/NH4FA (20 mmol/L, pH 6.01): 95/5(体积比);(b)ACN/NH4FA (100 mmol/L, pH 6.31): 95/5(体积比)；分析物: 1, 3,5-二羟基苯甲酸; 2, 对甲苯甲酸; 3, 肉桂酸; 4, 3,5-二硝基苯甲酸; 5, 对溴苯甲酸；6，胸腺嘧啶；7，尿苷；8，腺苷；9，腺嘌呤；10，胞嘧啶.其他色谱条件同图3图4 芳香酸(a)和核苷碱基(b)的分离Fig.4 Separation of organic acids (a) and nucleoside base (b) by C18/TMA

条件：流动相，MeOH/H2O(体积分数见图)；其他色谱条件同图3图5 水含量对多环芳烃保留因子的影响Fig.5 Effect of water content in mobile phase on the retention of PAHs on C18/TMA column

条件: 流动相，50 mmol/L NH4FA；分析物：1, 尿嘧啶; 2, 尿苷;其他条件同图3图6 停流测试Fig.6 Stop-flow test

2.6 药物分析应用

2.6.1 碱性药物的分离

本研究所得固定相，因为季胺基的存在，形成了电荷屏蔽层，理论上可在一定程度上改善碱性药物分析的拖尾现象。阿米替林是用于治疗原发性失眠的抗抑郁药物，临床上主要用于抑郁、焦虑、精神紊乱等症状，分析中常用其盐酸盐。盐酸阿米替林结构中含有强碱性季胺基团，会与硅胶表面发生静电作用，导致其峰形出现严重拖尾，也导致载样量大大减低。为验证C18/TMA固定相上的季胺基团实现了对游离硅羟基的电荷屏蔽作用，以盐酸阿米替林作为分析物，对比了自制C18反相柱、商品化C18柱和自制C18/TMA柱的柱效与拖尾因子，结果如图7。阿米替林在C18/TMA柱上的峰形相较于其他两根色谱柱有明显改善，商品化色谱柱的拖尾因子(3.78)是C18/TMA(1.08)的3.5倍，且柱效只有C18/TMA的一半；C18/TMA的柱效约为Sil-C18的6倍，拖尾因子也有明显降低(Sil-C18拖尾因子1.61)，充分证明了电荷屏蔽作用的存在。

条件: 流动相，MeOH/H2O:80/20(体积比)；检测波长，240 nm；进样量，5 μL；其他条件同图3 图7 阿米替林在C18/TMA、Sil-C18和XUnion C18色谱柱的分离对比Fig.7 Comparison of tailing of amitriptyline on C18/TMA, Sil-C18 and XUnion C18 (commercial)

2.7 重现性与稳定性考察

重现性和稳定性是评价色谱柱性能的重要指标，选择4-硝基苯胺、腺嘌呤、苯并菲、对溴苯甲酸作为重现性实验的分析物，在同一色谱条件下，日内连续进样6次，结果如图8(a)所示，四种样品的保留重现性好，保留时间的RSD在0.06%～0.19%范围内；日间重现性结果如图8(b)所示，日间保留时间和峰面积重现性如图8(c)。四种样品日间保留时间的RSD在0.20%～1.47%范围内，显示出良好的重现性；另外，选择多环芳烃、小分子碱、核苷和有机酸为分析物考察了C18/TMA色谱柱的运行稳定性。在乙腈/缓冲盐的淋洗条件下，每隔2 h进样，每次平行进样3次，连续淋洗34 h(约1 000倍柱体积)，统计分析物的保留参数变化，结果如8(d)所示。连续运行34 h后，4种分析物的保留时间RSD在0.09%～1.49%范围内，峰面积的RSD≤1.0%，理论塔板数的RSD≤1.52%，表现出良好的运行稳定性。

条件: 流动相,ACN/H2O/NH4FA(100 mmol/L,pH 6.1)80/10/10(体积比); 分析物: 1, 4-硝基苯胺; 2, 腺嘌呤; 3, 苯并菲; 4, 对溴苯甲酸; 其他条件同图3图8 C18/TMA色谱柱日内重现性(a)、日间重现性(b)、保留时间和峰面积(c)、运行稳定性(d) Fig.8 Intra-day (a), inter-day(b) reproducibility, retention time and peak area (c), and running stability(d)