于 红，马美娜，周真真，郭庆夺，于红美

(河北省沧州市中心医院麻醉科，河北 沧州 061000)

中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞核小胶质细胞等构成，而星形胶质细胞在维持神经元代谢及谷氨酸平衡中扮演着重要角色，一旦缺血再灌注损伤发生后，由于能量代谢及氧供需失衡，可诱发星形胶质细胞和神经元的死亡[1-3]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在调控星形胶质细胞线粒体氧化应激中发挥着重要作用，抑制PKA过度激活能够减轻氧化应激造成的细胞凋亡和焦亡[4]。既往研究表明，PTEN诱导性激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1) E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases，Parkin)途径是特异性调控线粒体自噬的信号通路[5-6]，抑制PKA表达上调可减少PINK1募集细胞质内的Parkin，减轻线粒体过度损伤和自噬[7]。本研究拟通过建立体外大鼠原代星形胶质细胞氧糖剥夺-复糖复氧模型，以揭示PKA-PINK1/Parkin信号通路在神经系统缺血再灌注损伤中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 24 h内的SD新生大鼠，共168只，北京维通利华实验动物技术有限公司负责提供(SYXK(京)2012-0036)。分离脑组织后，行原代大鼠皮质星形胶质细胞培养，并将所分离培养的原代大鼠星形胶质细胞分为4组，每组42只，分别为对照组(C组)、氧糖剥夺组(oxygen-glucose deprivation，OGD/R组)，H89+氧糖剥夺(H89+OGD/R, HO组)，H89对照组(H组)。其中，凋亡率、焦亡率、生存率、钙离子浓度测定、ROS测定、PKA测定、蛋白免疫印迹实验(Parkin和Pink1表达测定)各需要6只大鼠。

1.2原代大鼠皮质星形胶质细胞培养 出生24 h内的SD大鼠，在无菌平衡盐溶液(D-Hank液)中将大鼠的脑皮质充分剥离，并将皮质剪碎后放置在15 mL的无菌离心管内，取与细胞容积等量的胰酶(0.125%，HyClone，美国)加入离心管内，使其终浓度为0.062 5%，5% CO2培养箱内消化10 min，并在消化至5 min时轻摇1次。……