孙娜 姚聪 沈芯 王军 袁纯辉 向贇

1华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉430016）；2湖北中医药大学（武汉430065）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种高度传染性的慢性疾病，严重危害儿童健康。2018年全球新发现的结核病儿童约112 万例，死亡儿童高达20 万［1］。儿童自身免疫力弱，感染MTB 后容易发展成活动性结核，但因临床表现不典型和诊断方法自身的局限性，很容易造成漏诊、误诊。

MTB 为胞内寄生菌，进入人体后，机体免疫系统以白细胞分化抗原CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞介导的细胞免疫为主要应答模式［2］。在小鼠感染模型中，CD8+T 细胞对于维持结核潜伏感染状态至关重要［3］。颗粒酶B（granzyme B，GrB）是发挥细胞毒作用的主要效应分子，能够迅速引起靶细胞DNA 的断裂，导致细胞凋亡［4-5］。OUNI 等［6］报道MTB 分泌抗原Rv0140 诱导的GrB 能够区分ATB和LTBI，并且淋巴结结核的发生与CD4+T 和CD8+T表达GrB 减少有关。相比于IFN⁃γ主要由CD4+T 细胞分泌，GrB 可由CD8+T 和CD4+T 共同分泌，对诊断结核可能具有更高的敏感度［7-8］。本研究通过检测6 kD 早期分泌靶向抗原（ESAT⁃6）和10 kD 培养滤过蛋白（CFP⁃10）刺激外周血单个核细胞（pe⁃ripheral blood mononuclear cells，PBMCs）后GrB 水平，评估其作为儿童结核诊断生物标志物的潜力。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器AIM⁃V 细胞培养液（天津灏洋华科生物科技有限公司）；ESAT⁃6/CFP⁃10 抗原（英国Oxford Immunotec 公司）；颗粒酶B 预包被ELISA试剂盒（北京达科为生物技术有限工司）；淋巴细胞亚群检测试剂盒、BV⁃510⁃anti⁃INF⁃γ、BV510⁃anti⁃Granzyme B、FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD 公司）；固定液、破膜剂（美国BioLegend 公司）；血细胞分析仪XS⁃1000i（日本Sysmex 公司）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

1.2 研究对象选取2019年1⁃8月武汉金银潭医院就诊的结核病患者26 例作为活动性结核（active tuberculosis，ATB）组，包括19 例肺结核和7例肺外结核，其中男12例，女14例，年龄1 ～15岁，中位数6.5 岁；……