刘腾飞，安骄娜，朱 翊，张苏芮

黑色素瘤是一种侵袭性的黑色素细胞，其恶性程度较高，预后较差[1]。据统计，黑色素瘤的发病率在我国正不断上升,已成为较为严重的恶性肿瘤之一[2]。线粒体是细胞内的半自主性细胞器，在细胞能量代谢、活性氧生成、细胞凋亡等方面发挥着重要作用[3]。线粒体具有自己的DNA，但与细胞核DNA相比，线粒体DNA(mtDNA)缺乏具有保护作用的组蛋白，且DNA修复能力较低，因此极易受到活性氧和其他类型的遗传毒性损伤[4]。有相关研究表明，mtDNA的异常在神经退行性疾病、线粒体肌病等众多疾病中起关键作用，且与黑色素瘤密切相关[5]。黑素细胞系对活性氧的增加极为敏感，而黑素细胞依赖于有效的抗氧化措施[6]。因此，mtDNA拷贝数的变化可以通过影响抗氧化能力，从而改变黑素细胞的活性氧水平，导致黑素细胞癌变[7]。因此，本研究对mtDNA拷贝数在黑色素瘤术后复发患者中的表达及与临床病理指标的关系展开探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年5月—2020年8月安国市医院收治的40例黑色素瘤术后复发患者为病例Ⅰ组以及48例黑色素瘤初发患者为病例Ⅱ组。纳入标准：年龄20～80岁；病例Ⅰ组有黑色素瘤发病史，并行标准黑色素瘤根治术；未进行任何新辅助化疗。排除标准：中枢神经性疾病患者；严重肝肾功能不全者；预期生存时间<6个月。病例Ⅰ组男24例，女16例；年龄37～75(52.76±16.32)岁；根据2010年国际抗癌联盟发布的TNM分期(第七版)[8]标准分为：Ⅰ期4例，Ⅱ期12例，Ⅲ期17例，Ⅳ期7例。病例Ⅱ组男26例，女22例；年龄35～77(53.62±17.24)岁；TNM分期为：Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期23例，Ⅳ期3例。另选同期健康受试者50例为对照组。对照组男30例，女20例；年龄27～54(37.32±8.64)岁。

1.2主要试剂 血液DNA试剂盒购自北京天根生物有限公司，大肠杆菌DH10B感受态细胞购自北京华越洋生物科技有限公司，pUCm-T核实载体聚合酶链式反应(PCR)产物克隆试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司，Takara Premix Taq (Takara，货号：R004A)、限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRI (Takara) QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN)。

1.3实验方法

1.3.1基因组DNA提取：所有患者在术前取外周血10 ml,手术中取切除的黑色素瘤标本，癌组织：癌中心部位组织；癌旁组织：切缘2 cm处组织。对照组仅取外周血。所有标本用饱和酚-氯仿-异戊醇法提取核DNA及mtDNA。使DNA全溶于TE buffer溶液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10 mmol/L，乙二胺四乙酸1 mmol/L，pH=8.0)，使用紫外分光光度计测量其波长到达260 nm时的吸光度值,对DNA浓度进行计算,最后放置于-20℃环境下保存备用。

1.3.2质粒DNA的克隆与鉴定：PCR扩增全长1284 bp的mtDNA的D-loop区引物，反向引物：5'-TTGAGGAGGTAAGCTACAT-3'，正向引物从15 885～15 904：5'-CCTGTCCTGTAGTATAAAC-3'。PCR反应管中加入反向引物1 μl，正向引物1 μl，模板DNA 5 μl,Takara Premix Taq 25 μl，添双蒸水至终体积50 μl。PCR扩增：94℃预变性5 min； 94℃变性10 min， 53℃退火1 min， 72℃延伸2 min，35个循环后再进行72℃延伸7 min。PCR扩增产物与pUCm-载体进行连接后，于大肠杆菌DH10B中克隆，采用碱裂解法对质粒DNA进行制作备用。

1.3.3标准品制备：使用限制性Hind Ⅲ酶切质粒和内切酶EcoRI使其呈线形。倍比稀释质粒DNA,制作6个实时定量PCR标准液。

1.3.4实时定量PCR：标准为包含D-loop区的pUCm-T载体,实时定量PCR(反向引物从582～599：5'-TTGAGGAGGTAAGCTACAT-3'，正向引物从483～500：5'-ATCAATACAACCCCCGCC-3'，扩增全长117 bp)测定mtDNA。使用实时定量PCR反应试剂盒进行测定，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1不同组织mtDNA拷贝数比较 病例Ⅰ组及Ⅱ组肿瘤组织mtDNA拷贝数均显著高于癌旁组织，且病例Ⅰ组肿瘤组织mtDNA拷贝数显著高于病例Ⅱ组，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时病例Ⅰ组及Ⅱ组外周血mtDNA拷贝数显著高于对照组，且病例Ⅰ组显著高于病例Ⅱ组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组不同组织mtDNA拷贝数

2.2不同TNM分期肿瘤组织mtDNA拷贝数比较 病例Ⅰ组不同TNM分期肿瘤组织mtDNA拷贝数均显著高于病例Ⅱ组，且2组中肿瘤组织mtDNA拷贝数Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 病例Ⅰ组和Ⅱ组不同TNM分期肿瘤组织mtDNA拷贝数比较

2.3病例Ⅰ组肿瘤组织mtDNA拷贝数与临床病理指标的关系 以病例Ⅰ组肿瘤组织mtDNA拷贝数中位数(8.38×1013copy/μg DNA)为界值分为高拷贝数组20例和低拷贝数组20例,统计2组拷贝数与临床病理指标的关系发现，肿瘤组织mtDNA拷贝数与淋巴结转移显著相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 病例Ⅰ组肿瘤组织mtDNA拷贝数与临床病理指标的关系(例)

3 讨论

恶性黑色素瘤是由于黑色素细胞异常产生的，其恶性程度极高且预后较差。近年来，黑色素瘤的发病率正在逐年上升，据相关统计显示，全球每年约有20万新发的黑色素瘤病例出现[9]。线粒体功能缺陷是肿瘤发生及发展的重要原因之一[10-11]。机体能量代谢的变化及氧化磷酸化相关酶活性和mtDNA拷贝数的降低与众多实体肿瘤具有密切关联[12]。相较于核基因组，mtDNA缺少具有保护作用的组蛋白，且DNA修复能力较低，因此极易遭受致癌物质的攻击，是致癌物质的主要攻击靶点[13]。

在既往的研究中，mtDNA拷贝数与肿瘤的关系结果不一。流行病学研究表明，外周血中mtDNA拷贝数的增加与乳腺癌风险的增加显著关联；然而，其他研究显示外周血中mtDNA拷贝数的增加与患结直肠癌和肾癌的风险成反比[14-15]。还有研究显示，mtDNA拷贝数与胃癌风险无相关性[16]。

紫外线照射可促进黑素细胞色素的产生，阻断此机制通常可保护皮肤免受紫外线A和B对DNA的有害影响。然而，活性氧是黑色素生成的天然产物。原代培养的人黑素细胞中，黑色素与细胞内活性氧的积累和细胞抗氧化谷胱甘肽的减少有关[17]。抑癌蛋白p16Ink4a在黑素细胞的细胞周期控制中起着重要作用。Ink4a缺乏症可以显著增加痣积聚和黑色素瘤的发生风险。p16Ink4a可防止活性氧的积累，使活性氧与细胞周期调节功能脱钩。p16Ink4a缺乏症可增加多种细胞的活性氧水平，这种作用在黑素细胞中尤为突出，且呈黑色素依赖性。因此，黑素细胞中活性氧的增加不仅可能导致基因组DNA中潜在致癌基因突变，而且会对mtDNA造成明显的损伤。这种mtDNA损伤可能引起线粒体产生增加的代偿反应，从而保护线粒体基因组，维持正常功能。因此，在黑色素瘤中，mtDNA拷贝数的增加可以反映出细胞氧化应激水平的增加。Boulton和Birch-Machin[18]的研究报道了色素产生与线粒体产生活性氧的直接关系，提示色素产生、活性氧和线粒体之间存在着密切的关系。

本次研究对黑色素瘤初发及术后复发患者各组织中mtDNA拷贝数的变化进行了对比，发现病例Ⅰ组和Ⅱ组患者肿瘤组织内的mtDNA拷贝数相较于癌旁组织明显升高。且结果还发现，黑色素瘤复发患者肿瘤组织中mtDNA拷贝数与淋巴结转移具有密切联系，这提示在黑色素瘤中mtDNA拷贝数的升高，可以反映出肿瘤细胞淋巴结转移率的升高。同时本研究结果中，病例Ⅰ组及Ⅱ组患者外周血mtDNA拷贝数相较于健康受试者明显升高，这说明mtDNA拷贝数在黑色素瘤中具有较高的特异性及敏感性。

综上所述，mtDNA可以当作黑色素瘤筛查和术后监测的关键指标，为黑色素瘤的检测及预警提供了新的思路。