刘志伟，李新阳，王子明，任 婧，王新帅

食管癌作为消化系统恶性肿瘤之一，死亡率高，严重威胁人类的健康[1]。《2018年全球癌症统计》对全世界范围内185个国家36种癌症的发病率及死亡率的估计显示，2018年食管癌新发572 034例，其发病率和病死率分别在全球恶性肿瘤中居第七位和第六位[2]。同时中国食管癌新发及死亡病例约占全球病例的一半，《2015年中国恶性肿瘤流行情况分析》显示我国食管癌新发24.6万例，死亡18.8万例，其发病率和病死率分别在中国恶性肿瘤中居第七位和第四位[3]。由于食管癌早期无明显症状，大多数患者确诊时已是晚期，无手术根治切除的机会，传统放化疗尚不能明显提高患者远期生存率，近年来免疫治疗的兴起使多种癌症患者受益，同时也为食管癌精准治疗提供了一种新的治疗方式。基于此，进一步探明更多影响食管癌免疫相关基因显得尤为必要。因此，本研究在转录组水平上通过对比分析食管鳞癌与正常组织的基因表达差异性，探寻食管鳞癌免疫相关基因，并验证其有效性，为食管鳞癌免疫治疗提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据下载及预处理研究采用Rstduio(3.6.3版本)下载函数，从GEO数据库获得GSE75241基因表达矩阵及平台信息GPL5175[HuEx-1_0-st] Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array[transcript (gene) version]。基因表达矩阵GSE75241共纳入15例食管鳞癌组织样本及15例癌旁组织样本，借助标准化函数降低数据间的差异性，使基因表达数据具有较好的一致性，基于平台信息将探针名转化为基因名以用于下一步分析。

1.2 免疫相关基因鉴定基于Rstduio的相关软件包Limma(3.42.2版本)综合对比分析食管鳞癌组织与癌旁组织的基因表达矩阵，得到差异分析矩阵。差异基因定义为FDR<0.01及|logFC|≥1。Ggplot2包(3.3.0版本)用于绘制火山图和可视化差异分析结果。本研究从在线分析免疫相关基因的数据库Immport下载得到2 498个免疫相关基因，进一步结合分析差异基因，确定具有显著差异性的免疫相关基因。

1.3 PPI网络构建及关键免疫相关基因确定STRING(https://string-db.org/)数据库用于评估蛋白质的相互作用(protein-protein interaction，PPI)和网络内基因的量化关系。关键基因(key genes)是指与网络内其他基因高度相关，并对整个网络有重要影响的基因。关键免疫相关基因依据基因之间的关联度(degree)筛选分析。

1.4 关键免疫相关基因分析验证及miRNA预测GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库可以根据肿瘤类型对比分析肿瘤与正常组织中关键基因的差异表达情况，并用箱线图可视化验证。基于Kaplan Meier-plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库验证关键基因对生存预后的影响。MiRWalk数据库(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)是一个多物种综合性的miRNA靶基因数据库，选择靶位点在3’-UTR区域相关性>95%的miRNA用于预测关键免疫相关基因的miRNA。

1.5 统计学方法本研究统计学计算及分析采用

Rstduio(3.6.3版本)和相关软件包，以P<0.05为有统计学意义，FDR(false discovery rate)指调整后的P值。

2 结果

2.1 数据下载及预处理本研究通过R下载函数获得GSE75241基因表达矩阵及GPL5175平台信息。通过标准化及探针转化，得到17 324个基因和30例食管组织样本(15例食管鳞癌组织和15例癌旁组织)构成的基因表达矩阵。

2.2 免疫相关基因鉴定基于Limma包差异分析17 324个基因，得到基因的差异表达矩阵。以“FDR<0.01及|logFC|≥1”为筛选条件，共得到1 437个显著差异表达基因(841个上调差异基因和596个下调差异基因)，如图1所示，红点代表841个上调基因，绿点代表596个下调基因。进一步将1 437个差异基因与2 498个免疫相关基因结合分析，发现差异基因中存在169个显著差异的免疫相关基因(130个上调、39个下调)，如图2所示。

图1 差异基因火山图

图2 免疫相关基因鉴定

2.3 PPI网络构建及关键免疫相关基因确定本研究将130个上调和39个下调免疫相关基因上传至STRING在线数据库得到基因之间的量化关系。基于基因之间的量化关系，通过Cytoscape软件绘制上调及下调免疫相关基因的PPI网络并行可视化分析。选取上调免疫相关基因PPI网络基因关联度≥65的基因作为关键免疫相关基因，选取下调免疫相关基因PPI网络基因关联度≥7的基因作为关键免疫相关基因。如图3A和3B所示，上调关键免疫相关基因为IL-6(白介素6)、CXCL8(白介素8)，下调关键免疫相关基因为IL-18(白介素18)。

A：上调免疫相关基因PPI网络；B：下调免疫相关基因PPI网络。图3 免疫相关基因PPI网络

2.4 关键免疫相关基因分析验证及miRNA预测本研究基于GEPIA在线数据库分析IL-6、CXCL8和IL-18在食管癌及正常食管组织中的基因表达水平。如图4所示，对比正常食管组织，IL-6和CXCL8在食管癌组织内高表达，而IL-18在食管癌组织内低表达。进一步将IL-6、CXCL8和IL-18上传至Kaplan Meier-plotter数据库分析基因表达水平对食管癌患者总生存期(overall survival,OS)的影响，如图5所示，IL-6和CXCL8高表达与食管癌患者较短的总生存期相关(P<0.05)，而IL-18表达与食管癌患者生存期无相关性(P>0.05)。基于miRWalk数据库获得与IL-6、CXCL8和IL-18有关的miRNA，得到与IL-6显著相关miRNA 75个，与CXCL8显著相关miRNA 206个，与IL-18显著相关miRNA 199个，通过绘制维恩图发现miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18(图6)。

红色：食管癌组织; 黑色：正常食管组织。图4 关键免疫相关基因在食管癌和正常组织中差异表达

图5 关键免疫相关基因OS评估

图6 免疫相关基因miRNA靶标预测

3 讨论

食管癌是世界第七大常见癌症，中国食管癌发病率居世界首位。免疫治疗通过刺激免疫系统消灭肿瘤，相比于传统放化疗，其药物毒性作用少，已使越来越多的患者受益[4]。目前，免疫治疗在食管癌中的研究逐渐展开，挖掘食管癌免疫相关基因，对于食管癌免疫治疗尤为必要。

本研究通过差异对比分析食管鳞癌与正常组织的基因表达量，鉴定出与免疫基因显著相关的差异基因169个，通过分析免疫相关基因PPI网络，确定关键免疫相关基因为IL-6、CXCL8(上调)和IL-18(下调)。对比分析正常食管组织，IL-6和CXCL8在食管癌组织中高表达，而IL-18在食管癌组织中低表达(图4)，与差异分析结果一致。生存分析显示IL-6和CXCL8的高表达与患者较短总生存期相关(P<0.05)，IL-18表达虽然与食管癌免疫相关，但与患者生存期无显著相关性(P>0.05)。综合分析IL-6、CXCL8和IL-18相关miRNA，发现miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18，提示miR-6806-5p可能共同调控IL-6、CXCL8和IL-18的表达。

IL-6是一种多功能促炎细胞因子[5]，在恶性肿瘤的发病和发展过程中起重要作用[6]。已证实，IL-6在黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌等多种癌症中高表达[7-9]，且与癌症患者生存率呈负相关[10]。IL-6主要通过JAK2-STAT3、Ras-MAPK和PI3K-Akt信号通路促进肿瘤细胞扩增及新生血管的生成[6，11-12]。肿瘤免疫逃逸与IL-6调节多种免疫细胞(T细胞、树突状细胞及巨噬细胞)有关[13-14]。CXCL8是一种由多种肿瘤细胞产生能吸引髓系白细胞的促炎性趋化因子[15]。CXCL8同样在多种肿瘤细胞中高表达，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。且血清白介素8的高水平与疾病进展有关[16]。CXCL8由肿瘤细胞通过旁分泌或自分泌产生后，与趋化性受体CXCR1或CXCR2相互作用，可以改变肿瘤微环境内免疫细胞的构成或促进致癌信号、血管生成及多药耐药[17]。最新研究表明，肿瘤细胞分泌CXCL8可以促进髓系来源的抑制细胞浸润，进一步导致T免疫细胞受抑制引起肿瘤免疫逃逸[18]。IL-18属于白介素1家族，是一种免疫刺激细胞因子[19]。由活化的免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等)产生的IL-18可以刺激Th1或自然杀伤细胞产生IFN-γ，促进淋巴细胞增殖增强体内免疫系统。各种肿瘤细胞都会产生IL-18诱导癌细胞侵袭、转移和增殖[20]。miRNA靶标预测发现miR-6806-5p共同调控IL-6、CXCL8和IL-18，目前miR-6806-5p的生物学功能尚不清楚，但是其靶向性可能作为研究食管癌免疫治疗的一个新靶标。

综上所述，本研究基于综合数据分析，对比食管鳞癌与正常食管组织的基因表达谱，鉴定与食管癌显著相关的免疫基因，表明IL-6、CXCL8和IL-18通过影响免疫细胞，可能会导致肿瘤免疫逃逸的发生，并进一步预测出共同调控IL-6、CXCL8和IL-18的miRNA(miR-6806-5p)，为食管鳞癌免疫治疗提供一定的理论依据。