梅佳林，刘权伟，李婷婷，励建荣,，牟伟丽，郭晓华

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600；3.蓬莱京鲁渔业有限公司，山东 烟台 265600；4.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276815）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）因具有口感好、肉质佳、营养丰富等优点而被消费者广泛认可[1]，但其在冷藏运输的过程中易受微生物的污染，发生腐败变质，影响产品货架期[2]。因此，研究一种行之有效的保鲜方法十分必要。

纳米纤维因其直径小、比表面积大、透气性和孔隙率高等特性而被各行业广泛应用[3-4]。制备纳米纤维的方法很多[5-6]，静电纺丝具有操作方法简单、设备价格便宜、纤维精密度高等优势，被众多研究者所青睐[7]。壳聚糖（chitosan，CS）及其衍生物有良好的抗菌性能，对细菌、真菌等都具有较强的抗菌活性[8]，其因较好的生物相容性[9]和降解性[10]已被广泛应用于生物、医学、食品等领域[11-12]。李硕[13]采用单针头和螺旋片式静电纺丝设备制备出CS/聚乙烯醇（polyethylene alcohol，PVA）纳米空气滤芯，不仅可以吸附大量微小污染物，还能有效防止细菌滋生。Jiang Yongli等[14-15]采用静电喷雾技术利用不同分子质量和不同脱乙酰度的CS制备草莓保鲜涂层，发现CS涂层有效地提高了草莓的整体品质，延长了草莓的货架期至少2 d。

香兰素（vanillin，V）是一种天然香料，常被用在食品、化妆品和医药产品中作为抗氧化剂和防腐剂[16-17]。有研究表明香兰素分子中的醛基能与CS分子的氨基反应形成CS席夫碱键[18]，与单一的CS相比不仅具有更好的抗菌性能，还能固定香兰素，使其不易挥发[19]。de Vrieze等[20]的研究证明了CS具有较高的黏度和分子质量，难以单独纺丝，因此本实验加入聚合物稳定剂PVA[21]以增强纤维膜的可纺性。

目前，国内外学者已有将静电纺丝技术应用于食品领域的研究[14-15,22]，但鲜有针对水产品保鲜的研究。本实验通过制备CS/V/PVA纳米纤维膜，测定其各项理化指标，并研究纤维膜对大菱鲆鱼片的保鲜效果，以期为更好地将静电纺丝技术应用于水产保鲜领域提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C S（脱乙酰度大于9 0%）、香兰素北京索莱宝科技有限公司；72000型PVA（相对分子质量65 000～75 000）上海生工生物工程有限公司；冰乙酸、无水乙醇等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

ET-2535H型静电纺丝设备北京永康乐业科技发展有限公司；S-4800型冷场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）日本日立公司；Scimitar 2000傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪美国安捷伦公司；Rigaku Ultima IV型X射线粉末衍射仪日本理学公司；Q2000-3236型差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）美国TA仪器公司；PYRIS DIAMOND热重/热差分析（thermogravimetry/differential thermal analysis，TG/DTA）仪、PE Victor X3多功能酶标仪美国铂金埃尔默仪器；UV-2550紫外-可见分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司；Biofuge Strato台式高速离心机美国Thermo Fisher公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪丹麦FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 纺丝液及共纺纳米纤维膜的制备

参考李硕[13]的方法，配制终质量分数为1%的CS溶液，添加1%的乙酸营造酸性环境，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌1 h至CS完全溶解，再向CS溶液中加入以适量无水乙醇溶解的香兰素，最终形成质量比为1∶1的CS/香兰素混合纺丝液，将其加入到终质量分数8%的PVA溶液中，搅拌6～8 h至各组分均匀，静置12 h，最终得到CS/V/PVA混纺液。在正电压（12±1）kV、负电压（-1.7±0.1）kV、接受距离（15.0±0.1）cm、纺丝液流量0.55 mL/h的条件下制备CS/V/PVA共纺纳米纤维膜。单PVA膜使用单轴纺丝工艺在正电压为10 kV、负电压为-1.5 kV、接受距离15 cm、流量0.4 mL/h的条件下制备。

1.3.2 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的结构表征

取适当厚度的纺丝样品，用K B r 压片法测定纤维膜及其各单组分的F T I R 光谱，光谱扫描范围为4 000～400 cm-1；对纤维膜进行喷金处理，利用SEM观察纤维膜的微观形貌，并采用ImageJ图像分析软件在SEM图像中随机选取100 根纳米纤维测量直径并计算其平均直径；用CuKα辐射，在管压40 kV、电流50 mA、测量角2θ扫描范围5°～70°的条件下对纤维膜及其单组分样品进行X射线衍射（X ray diffraction，XRD）并分析其结晶度。

1.3.3 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的热力学特性测定

用分析天平称取5 mg的纤维膜及其单组分样品，在扫描范围为20～250 ℃的氮气环境中进行DSC分析，升温速率为10 ℃/min；用分析天平称取3 mg的纤维膜及其单组分样品，研磨均匀，以10 ℃/min的升温梯度，在温度范围为40～700 ℃的氮气环境中，使用TG/DTA仪进行测定。

1.3.4 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜抑腐败希瓦氏菌性能测定

参考Ding Ting等[23]的方法，以典型的水产品腐败菌——腐败希瓦氏菌为测试菌株，采用抑菌曲线法评价CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的抑菌效果。取本实验室-80 ℃保存的腐败希瓦氏菌，经二代活化后得到对数生长期的菌悬液，吸取1 mL菌悬液加入到50 mL LB肉汤培养基中，充分振荡混匀后再加入0.5 g CS/V/PVA共纺纳米纤维膜，并以加入同等质量的PVA膜和空白（不添加任何物质）作为对照，在28 ℃、160 r/min的摇床中培养24 h，分别于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h取样，在波长595 nm的条件下测试菌液的OD值。实验前对纤维膜紫外辐照灭菌处理30 min，并对所有玻璃器皿和塑料器皿进行灭菌处理。

1.3.5 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜对大菱鲆的保鲜性能测定

1.3.5.1 原料处理

将大菱鲆用碎冰致死，去皮和内脏，切取背脊部鱼肉，用蒸馏水清洗，再将鱼块放在铺有保鲜膜的无菌操作台上，用无菌水洗涤两次，用滤纸沥干[24]。取若干张以3 mL纺丝液制备的纺丝膜，置于紫外辐照下灭菌处理2 h，再用纤维膜包裹适当大小的鱼片，外部裹上一层紫外灭菌过的锡纸以固定纤维膜（以不用纤维膜、仅锡纸包裹的鱼片作为对照），装入无菌蒸煮袋中密封包装，贮藏于4 ℃冰箱中，每3 d测定样品的菌落总数、pH值、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，每组实验至少2 个平行。

1.3.5.2 菌落总数测定

菌落总数的测定参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[25]，取10 g鱼肉置于已灭菌的蒸煮袋中，加入90 mL无菌生理盐水（0.85 g/100 mL），拍打均质120 s。将均质液进行10 倍系列稀释。适当选取2～3 个稀释倍数的稀释液，分别取1 mL加入至无菌培养皿中，再倾注约20 mL已灭菌的平板计数琼脂培养基，摇匀，每个稀释度做3 个平行。待琼脂凝固后，倒置于28 ℃培养箱中培养48 h，最后进行菌落计数。

1.3.5.3 TBA值测定

TBA值的测定参考丁婷等[26]的方法并略作修改，取10 g绞碎的鱼肉，加25 mL蒸馏水以及25 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液均质，过滤，弃去初滤液，取5 mL上清液，加入0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液5 mL，80 ℃水浴反应40 min，冷却后于532 nm波长处测吸光度。以不加鱼肉的溶液作空白调零。

1.3.5.4 TVB-N含量测定

TVB-N含量测定参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[27]，准确称取5 g鱼肉于750 mL的蒸馏管中，加入0.5 g氧化镁粉末，再使用全自动凯氏定氮仪蒸馏、滴定并进行计算。

1.3.5.5 pH值测定

准确称取5 g绞碎样品放置于烧瓶中，加入45 mL蒸馏水，均质后静置30 min，过滤，弃去初滤液，滤液用pH计测定。

1.4 数据处理分析

各项指标均使用Origin 8.5软件进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的形貌分析结果

图 1 电纺纤维膜的SEM图（A）和直径分布图（B）Fig. 1 SEM (A) and diameter distribution (B) of electrospun fiber film

从图1可以看出，PVA具有优良的纺丝性能，静电纺丝PVA纤维具有质地紧密的多层网状结构，纤维直径集中分布在150～225 nm之间；而CS/V/PVA共纺纳米纤维膜纤维直径显著增大，较均匀地分布在200～350 nm之间，总体形貌较好，但存在些许黏连。一般来说，纳米纤维的直径随着纺丝液黏度的增加而增大，由于CS的存在，CS/V/PVA共纺液的黏度会大幅增加，因此共纺纳米纤维膜纳米纤维的直径较PVA膜明显增大，这与闫尔云等[28]的研究结果一致。共纺纳米纤维膜有部分纺丝纤维黏结在一起，这是由于喷射口处的小液滴在强电场力的作用下以泰勒锥的形式喷出，使得溶剂易挥发，而当电压不足或流速较大时，溶剂未完全挥发，就会导致纺丝纤维出现些许黏连，影响纺丝纤维的整体形貌[20]。李德朴[29]验证了纺丝电压等因素对电纺纤维的影响，结果表明只有当电压达到某一临界值时，针头的液滴才能喷出，形成泰勒锥。当电压过高或过低时，带电射流都会变得不稳定，难以形成形貌良好的纤维。

2.2 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的FTIR分析结果

图 2 CS、香兰素、PVA膜和CS/V/PVA共纺纳米纤维膜FTIR图Fig. 2 FTIR spectra of CS, vanillin, PVA films and CS/V/PVA nanofiber films

由图2可知，在3 200～3 700 cm-1区域，CS、PVA膜和共纺纳米纤维膜在此区域内均存在一个较宽的吸收峰，通常将其归因于O—H伸缩振动，PVA是水溶性的多聚物，无论是单轴的PVA膜还是共纺纳米纤维膜均在此范围内显示出较大的吸收峰，这表明膜分子间存在着大量的氢键；而CS放置在空气中会吸收空气中的水分，因而会有氢键检出。CS在1 655 cm-1附近的吸收带由CS上酰胺基团和氨基的对称伸缩振动所引起，在1 087 cm-1左右的宽振动显示出其特殊的糖特征结构。PVA膜在2 937、2 912 cm-1处的峰为亚甲基（—CH2）中—C—H的伸缩振动峰；1 734、1 092、850 cm-1处分别显示出C＝O、C—O及C—C的特征吸收峰，这些特征峰在复合膜上均有体现，表明添加CS/V对PVA的化学结构无改变。香兰素的活性基团分别是醛基和酚羟基，在1 664 cm-1处呈现的吸收峰归因于C＝O的伸缩振动，酚羟基的特征振动峰在1 265 cm-1处呈现[30]。而在共纺纳米纤维膜上，香兰素的醛基和酚羟基以及CS的氨基特征峰并未出现，而是在1 645 cm-1处出现一个新的特征峰，其对应了C＝N拉伸振动，证实了席夫碱键的形成，与Xu Chuanhui等[18]的结论相符。由于静电纺丝时间的不同，纺丝膜的厚度会产生差异，红外光的透射率也会随之变化，因此在长波区CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的透射率随波数增加存在一个明显的下降趋势。

2.3 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的XRD分析结果

图 3 CS、香兰素、PVA和CS/V/PVA共纺纳米纤维膜XRD图Fig. 3 XRD patterns of CS, vanillin, PVA and CS/V/PVA nanofiber films

如图3所示，香兰素在2θ为13°处存在一个极强的衍射峰，这与它具有晶体结构特性一致。CS作为一种半晶聚合物，在2θ为20.1°和2θ为10.7°处分别出现了一个较强的衍射峰和一个较弱的衍射峰。PVA粉末在2θ为19.60°处出现一个尖锐的特征峰，在2θ为11.3°、22.7°、40.7°处的衍射峰较弱。PVA膜在2θ为19.6°处的衍射峰与PVA粉末相比变得较弱，这是由于PVA粉末溶于水之后再纺丝，原本的固态晶型被破坏，致使峰值变小或位移。而共纺纳米纤维膜仅在2θ为19.8°、28.6°处分别出现了一个较强的衍射峰和一个较弱的衍射峰，这表明共纺纳米纤维膜为非晶态的无定形物，但结构中存在着一定的有序性。若各单组分分子之间未发生或仅有微弱的相互作用，那么XRD图谱仅显示各组分衍射图谱按比例简单叠加[31]。从图3可以看出，CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的各衍射峰不仅仅是香兰素、CS和PVA三者衍射峰的简单叠加，在共纺纳米纤维膜的XRD图中，PVA和CS的各特征衍射峰均在一定程度上减弱或消失，表明在反应体系中各组分分子间存在较强的相互作用，从而导致单组分的结晶性发生变化。

2.4 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的热力学分析结果

图 4 CS、香兰素、PVA和CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的DSC图Fig. 4 DSC curves of chitosan, vanillin, polyvinyl alcohol and CS/V/PVA nanofiber films

从图4中可以明显地看到，香兰素在82 ℃附近出现唯一一个急剧下降的峰，这表明香兰素具有晶体结构。CS在122 ℃附近出现的吸热峰是由于CS粉末间结合水的汽化，与自身的热性能无关。PVA粉末仅在184 ℃处出现一个熔融吸热峰；而PVA膜则在65 ℃和190 ℃处均有吸热峰，在65 ℃附近小范围的波动可能与高聚物的玻璃化转变有关，而190 ℃处的吸热峰较PVA粉末峰高和峰宽均发生了变化，这可能是由于电纺丝工艺使聚合物的热稳定性发生改变。共纺纳米纤维膜在50、126、183 ℃ 3 处均出现向下的吸热峰，在50 ℃处的吸热峰可能是由于CS/V与PVA结合，降低了PVA的玻璃化转变温度，致使其向左发生了移动；在126 ℃处的吸热峰与CS的吸热峰相比，无论是峰形还是位置均发生了变化，这表明香兰素与CS发生了一定的化学反应，其结果与FTIR的结果相一致；而在183 ℃处的吸热峰较PVA膜明显变弱，这表明CS与PVA分子间存在强烈的相互作用，与张东栋等[32]的结论一致。

图 5 CS、香兰素、PVA膜和CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的TG曲线Fig. 5 TG curves of CS, vanillin, PVA films and CS/V/PVA nanofiber films

如图5所示，CS的热降解主要分为3 个阶段，在低于122 ℃时热质量损失主要归因于水分的流失，CS的质量损失率大约为11%；第二阶段为质量快速损失阶段，CS在240～320 ℃的质量损失率达到36%，主要是CS分子内各化学键的断裂所造成的；320～600 ℃为质量缓慢损失阶段，在此阶段剩余的CS开始逐渐碳化，最终仅剩2%左右的残渣。香兰素在140～230 ℃的范围内呈现出一个陡峭的质量损失趋势，主要是由于香兰素晶体的汽化。PVA膜的热降解主要分为两个阶段，第一阶段为250 ℃之前的热失水，质量损失率约为5%；第二阶段为250～550 ℃，在此阶段PVA的主链分裂，聚合物基体逐渐碳化分解。共纺纳米纤维膜的热降解过程主要分为3 个阶段，在230 ℃之前主要是膜内结合水的流失，大约占9%，这一阶段与PVA膜类似；第二阶段为230～490 ℃，这一阶段共纺纳米纤维膜开始逐渐降解，初始降解的温度明显低于PVA膜，主要是因为PVA的热降解受羟基和残留羧基的共同作用[33]，当添加CS和香兰素后，席夫碱键和分子间氢键的产生和旧基团的消耗促进了PVA的热降解，导致共纺纳米纤维膜的初始热降解温度变低；第三阶段为490～530 ℃，在此阶段组成共纺纳米纤维膜的各组分逐渐碳化分解，质量迅速下降，可以看出当剩余质量分数下降到10%时，PVA膜的温度大约为520 ℃，而共纺纳米纤维膜的温度为570 ℃，这表明CS和香兰素的添加改变了PVA膜的热稳定性，共纺纳米纤维膜的热稳定性相对于单纯的PVA膜有了一定的提高。

2.5 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜对腐败希瓦氏菌的抑菌性

图 6 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜对腐败希瓦氏菌的抑菌性能Fig. 6 Bacteriostatic activity of CS/V/PVA nanofiber membranes against Shewanella putrefaciens

在细菌生长过程中，菌悬液的OD595nm能大致反映细菌的生长状况，菌悬液中的细菌浓度与OD595nm呈正相关[34]。由图6可知，空白组和PVA膜处理组在24 h内的OD595nm均呈现出对数型增长的趋势，且加入PVA膜组的OD595nm较空白组略大，这可能是PVA膜的添加引入了空气中游离的细菌所导致，也证明了单独的PVA膜不具备抑菌效果。在相同条件下，加入CS/V/PVA共纺纳米纤维膜样品的OD595nm在2 h内突然增大，随后趋于平缓，在0.2附近小范围波动，这主要是由于CS/V/PVA共纺纳米纤维膜成膜是淡黄色的，加入到LB肉汤中会对其OD595nm的测定产生影响，这表明共纺纳米纤维膜具有良好的抑菌性能，对腐败希瓦氏菌的生长有明显的抑制作用。

2.6 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜对大菱鲆的保鲜效果

如图7 A 所示，第0 天大菱鲆鱼片的菌落总数为3.806（lg（CFU/g）），随着时间的延长呈现上升的趋势；第6天对照组的菌落总数达到了8.501（lg（CFU/g）），已超过国际食品微生物委员会对水产品可食用的微生物规定（≤106CFU/g），表明此时的鱼片已经开始腐败变质。与对照组相比，样品组的菌落总数上升较缓慢，但在第9天也超过了106CFU/g，这表明CS/V/PVA共纺纳米纤维膜能抑制微生物的生长，主要是因为CS带正电的氨基与带负电的微生物细胞膜之间相互作用，破坏了微生物细胞膜，导致微生物的蛋白质和其他细胞内成分的泄漏[14]。

TVB-N是蛋白质经微生物分解作用后产生的氨和胺类等碱性含氮物质，如图7B所示，大菱鲆鱼片的初始TVB-N含量为5.44 mg/100 g，样品组的TVB-N含量在贮藏的第15天为18.1 mg/100 g，而对照组第15天的TVB-N含量高达35.8 mg/100 g，此时鱼肉已完全腐败（TVB-N含量不低于30 mg/100 g）[35]，主要是由于共纺纳米纤维膜对水产品腐败菌有抑制作用，能杀死致腐微生物。

如图7C所示，大菱鲆鱼片在贮藏期间的pH值均呈现先下降后升高的“V”型趋势，在第6天到达最低点，随后迅速升高。这是由于在贮藏前期乳酸菌增殖并产生大量乳酸，使得pH值迅速下降，而后腐败微生物量增多，分解蛋白质产生碱性物质，导致pH值上升[26]。

图 7 CS/V/PVA共纺纳米纤维膜对大菱鲆的保鲜作用Fig. 7 Effect of CS/V/PVA nanofiber membranes on quality preservation of turbot

通过TBA与脂质氧化产生的丙二醛发生的颜色反应可判断脂质的氧化程度。如图7D所示，大菱鲆鱼片初始TBA值为0.27 mg/100 g，随着贮藏时间的延长，TBA值大体呈现先上升后下降的趋势，在第9天达到顶峰，在贮藏后期脂肪氧化产生的丙二醛与大菱鲆鱼片自身的氨基酸、核酸、核苷、蛋白质及醛类化合物等成分发生反应，致使TBA值下降[36]。

3 结 论

本研究采用单轴静电纺丝工艺制备CS/V/PVA共纺纳米纤维膜，通过SEM、FTIR、XRD、DSC和TG分析对共纺纤维膜的形貌和结构进行表征，再将其应用于大菱鲆4 ℃保鲜实验中。结果表明，CS/V/PVA共纺纳米纤维膜的微观结构良好，纤维直径均匀分布在200～350 nm之间；纤维膜各组分之间存在强烈的相互作用，香兰素分子中的醛基能与CS分子中的氨基反应形成席夫碱键，且CS、香兰素、PVA分子间有氢键形成，纤维膜各分子间能形成有序的网络结构；且纤维膜的热稳定性良好。通过测定共纺纤维膜抑菌性，发现其对腐败希瓦氏菌生长具有明显的抑制作用；并且CS/V/PVA共纺纳米纤维膜在一定程度上能抑制大菱鲆的腐败，延长鱼片的货架期，有望作为一种新型的包装材料应用于食品工业。