刘旺景，李书仪，段嘉钰，丁 赫，乔亚杰，刘玉蓉，吕可欣，郭艳丽,，敖长金,

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

4-烷基支链脂肪酸，如4-甲基辛酸（4-methyloctanoic，MOA）、4-乙基辛酸（4-ethyloctanoic，EOA）和4-甲基壬酸（4-methylnonanoic，MNA）通常沉积于动物脂肪组织中，普遍认为是引起羊肉膻味的主要化合物[1]。降低羊肉脂肪中4-烷基支链脂肪酸的含量能够提高消费者对羊肉的认可度和购买欲望[2]。有研究表明，随着日龄的增加，羊肉脂肪中4-烷基支链脂肪酸的沉积量越多，膻味越明显[3]；但也有研究结果表明，羊肉4-烷基支链脂肪酸的沉积量与其日龄的增加并无正相关关系，相反呈负相关，造成这种差异的原因可能是羊所采食牧草的刈割季节和营养成分含量不同[4]。肉羊日粮中添加苦荞单宁[5]或者葡萄籽提取物[6]均能降低羊肉中3-甲基吲哚（粪臭素）的生成，从而减轻羊肉异味。目前，对于羊肉致膻物质的研究主要集中于粪臭素，对于4-烷基支链脂肪酸的研究较少，主要原因在于4-烷基支链脂肪酸的富集及检测过程耗时且较为繁琐，且检测过程中所使用的设备及试剂耗材成本较高[7]。

沙葱是一种典型的百合科草本植物，广泛生长在中国北方沙漠化草原地区[8-10]。牧民多年经验证实，羊采食沙葱后生长速率加快，肉鲜而不膻。课题组前期研究结果证实，小尾寒羊日粮中添加沙葱黄酮能够显著降低羊背最长肌肌内脂肪中MOA和EOA的含量，从而改善羊肉风味[11]。目前为止，沙葱及其提取物对肉羊体脂致膻物质4-烷基支链脂肪酸沉积与分布的相关研究还鲜见报道。因此，本实验以小尾寒羊为对象，研究日粮中添加沙葱及其提取物对体脂4-烷基支链脂肪酸沉积与分布的影响，以期为低膻味甚至无膻味羊肉的生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙葱粉为内蒙古阿拉善左旗市售；按照张巧娥[12]的方法制备沙葱醇溶性提取物和沙葱水提物，所得醇溶性提取物和水溶性提物的提取率分别为28%和34%。

MOA、MNA、EOA、十一烷酸（纯度均大于98%）德国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FDU-2110真空冷冻干燥机东京理化器材株式会社；FW135中草药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；Trace 1310 ISQ气相色谱-质谱仪美国Thermo Fisher公司；Unitrex同时蒸馏装置江苏冠亚恒温制冷有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计与样品采集

实验于2019年4月15日—2019年6月28日在内蒙古巴彦淖尔市临河区富川饲料股份有限公司肉羊养殖示范基地进行。选取3 月龄体质量（（23.67±3.43）kg）相近、体况良好的健康小尾寒羊公羊60 只，随机分为4 组，每组3 个重复，每个重复5 只。对照组饲喂基础日粮；参考卢媛[13]实验所得绵羊最适沙葱粉饲喂量确定本实验沙葱粉添加量，根据沙葱水提物和沙葱醇提物的提取率进行换算，确定沙葱水提物和沙葱醇提物的添加量，实验组以每只羊计，分别在基础日粮中添加沙葱粉10 g/d、沙葱水提物3.4 g/d 和沙葱醇提物2.8 g/d 。沙葱醇提物中的主要活性成分为烷烃、氨类化合物、醇类、酸类和酚类，沙葱水提物中的主要活性成分为半胱氨酸衍生物、大蒜素、苯并吡喃衍生物和黄芪苷衍生物[12]。基础日粮参照美国国家委员会（2007）肉羊的营养需要量进行配制，其组成及营养水平见表1。实验持续75 d，其中预试期15 d，正试期60 d，每天于8∶00和18∶00分2 次等量饲喂，根据剩料量调整饲喂量，控制每个圈舍剩料量为饲喂量的10%，饲喂期间自由采食和饮水。正试期结束后从每组每个重复中挑选2 只体质量相近的小尾寒羊屠宰，取背部皮下脂肪（第6～7腰椎肌肉上方的脂肪组织）、尾部脂肪（中央位置）、肾周脂肪和大网膜脂肪（中央位置）各20～30 g，在-20 ℃条件下保存，用于检测4-烷基支链脂肪酸的含量。

表 1 基础日粮组成及营养水平（干物质）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet used in this study (on a dry matter basis)

1.3.2 4 -烷基支链脂肪酸的富集及检测

参照Kaffarnik等[7]的方法，将采集的不同部位脂肪组织去除表皮脂肪，用高温灭菌手术刀切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的碎块，用微波炉加热将其熔化。取1 g熔化后的脂肪将其注入Unitrex同时蒸馏装置中，在氮气流（200 mL/min）中加热1 h。萃取出的挥发性物质用Unitrex装置吹扫并收集到捕集器中，用5 mL二乙醚-己烷溶液（体积比20∶80）洗脱。将洗脱后的有机相浓缩至1 mL，加入内标物十一烷酸（1.00 mg/kg），用双甲硅烷基三氟乙酰胺于60 ℃条件下处理30 min，使4-烷基支链脂肪酸衍生为三甲基酯。根据相应脂肪酸标准物的保留时间进行4-烷基支链脂肪酸定性分析。

采用气相色谱-质谱联用法检测脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸的含量。将1 μL脂肪酸甲酯溶液注入气相色谱的DB5-MS熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm）中，过滤膜厚度250 μm，溶液通过滤膜分离后，在全扫描模式下运行离子阱质谱仪进行检测。无隔膜可编程进样器升温程序：初始温度45 ℃，并以180 ℃/min升温至325 ℃。气相色谱条件：升温程序：75 ℃下维持2 min，然后以10 ℃/min升温至300 ℃并维持8 min（沸点：MOA 149 ℃、MNA 292～293 ℃、EOA 163 ℃）；105 kPa恒定压力；载气氦气。质谱条件：传输线温度280 ℃；离子源温度220 ℃，电压2 400 V，使用全氟三丁胺校准质谱仪。使用Varian Saturn Workstation 2000软件对4-烷基支链脂肪酸进行定量。定量离子分别为：MOA-三甲基酯m/z215、MNA-三甲基酯m/z229、EOA-三甲基酯m/z229、十一烷酸m/z243。3 种4-烷基支链脂肪酸含量按下式计算。

式中：S样品表示样品中4-烷基支链脂肪酸峰面积；S内标表示内标物峰面积；k表示截距设置为零的线性校准曲线斜率。

1.4 数据处理与分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010软件进行整理，使用SAS 9.2软件中的方差分析程序进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异显著，差异显著性采用Duncan法进行多重比较。采用Spearman相关性分析法对羊体脂不同部位脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸沉积量间的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 沙葱及其提取物对肉羊体脂MOA沉积量的影响

表 2 沙葱及其提取物对肉羊体脂中MOA沉积量的影响Table 2 Effects of Allium mongolicum Regel and its extracts on MOA concentrations in different adipose tissues of lambs

由表2 可知，与对照组相比，日粮中添加沙葱粉、沙葱水提物和沙葱醇提物均能显著降低羊背部皮下脂肪、肾周脂肪和大网膜脂肪中MOA的沉积量（P＜0.000 1）。肾周脂肪中，沙葱醇提物组MOA沉积量显著低于沙葱粉组和沙葱水提物组（P＜0.000 1），沙葱粉组和沙葱水提物组间MOA沉积量无显著差异（P＞0.05）；背部皮下脂肪和大网膜脂肪中，3 组实验组间MOA沉积量均无显著性差异（P＞0.05）；尾部脂肪中，对照组与各实验组间MOA沉积量均无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 沙葱及其提取物对肉羊体脂EOA沉积量的影响

表 3 沙葱及其提取物对肉羊体脂中EOA沉积量的影响Table 3 Effects of Allium mongolicum Regel and its extracts on EOA concentrations in different adipose tissues of lambs

由表3可知，与对照组相比，日粮添加沙葱粉、沙葱水提物和沙葱醇提物均能显著降低背部皮下脂肪和肾周脂肪中的EOA沉积量（P＜0.000 1），且各实验组间EOA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。尾部脂肪中，各实验组与对照组间EOA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。大网膜脂肪中，各实验组中EOA沉积量与对照组相比呈降低趋势（P＝0.062 0），且各实验组间EOA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 沙葱及其提取物对肉羊体脂MNA沉积量的影响

表 4 沙葱及其提取物对肉羊体脂MNA沉积量的影响Table 4 Effects of Allium mongolicum Regel and its extracts on MNA concentrations in different adipose tissues of lambs

由表4可知，与对照组相比，日粮添加沙葱粉、沙葱水提物和沙葱醇提物均能显著降低肾周脂肪中MNA沉积量（P＝0.044 0），且各实验组间MNA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。背部皮下脂肪和尾部脂肪中，各实验组与对照组相比MNA沉积量均无显著性差异（P＞0.05），且各实验组间MNA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。大网膜脂肪中，各实验组MNA沉积量与对照组相比均有降低趋势（P＝0.066 0），各实验组间MNA沉积量无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 肉羊不同部位脂肪组织4-烷基支链脂肪酸沉积的差异

图 1 肉羊不同部位脂肪组织中MOA（A）、EOA（B）和MNA（C）沉积差异箱式图Fig. 1 Boxplots for differential deposition of MOA (A), EOA (B) and MNA (C)in adipose tissues from different anatomical locations of lambs

由图1A可知，日粮添加沙葱粉、沙葱水提物和沙葱醇提物后，MOA在尾部脂肪、背部皮下脂肪、大网膜脂肪和肾周脂肪中的沉积量分别为10.21～32.87、5.24～16.27、2.46～15.11 μg/g和1.17～11.43 μg/g，平均值分别为20.99、9.26、6.80 μg/g和5.21 μg/g。由图1B可知，EOA在尾部脂肪、背部皮下脂肪、大网膜脂肪和肾周脂肪中的沉积量分别为9.12～15.04、1.89～9.46、1.52～7.28 μg/g和1.10～6.59 μg/g，平均值分别为11.04、4.84、3.59 μg/g和2.60 μg/g。由图1C可知，MNA在尾部脂肪、背部皮下脂肪、大网膜脂肪和肾周脂肪中的沉积量分别为1.10～3.46、0.23～1.85、0.26～1.58 μg/g和0.26～1.09 μg/g，平均值分别为2.11、0.92、0.75 μg/g和0.61 μg/g。3 种4-烷基支链脂肪酸在肉羊不同部位体脂的沉积量均呈尾部脂肪＞背部皮下脂肪＞大网膜脂肪＞肾周脂肪的规律。

2.5 肉羊不同部位脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸沉积量间的相关性

表 5 肉羊不同部位脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸沉积量间的相关性Table 5 Correlational analysis among deposition levels of 4-branched-chain fatty acids in adipose tissues from different anatomical locations of lambs

如表5所示，尾部脂肪中，MOA与EOA、MOA与MNA及EOA与MNA间均无显著相关性。背部皮下脂肪中，MOA与EOA（[ρ]＝0.610，P＝0.001）具有显著相关性，MOA与MNA（[ρ]＝0.490，P＝0.016）、EOA与MNA（[ρ]＝0.450，P＝0.029）间相关性较弱。大网膜脂肪中，MOA与EOA间具有相关趋势（[ρ]＝0.390，P＝0.060），MOA与MNA及EOA与MNA间均无显著相关性。肾周脂肪中，MOA与EOA（[ρ]＝0.700，P＝0.001）、MNA（[ρ]＝0.660，P＝0.001）具有显著相关性，EOA与MNA间的相关性较弱（[ρ]＝0.507，P＝0.004）。

3 讨 论

3.1 沙葱及其提取物对肉羊体脂膻味物质4-烷基支链脂肪酸沉积的影响

近年来众多研究结果表明，肉羊脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸的沉积是导致羊肉产生不良气味，即“膻味”的主要原因[2,14-15]。Brennand等[16]研究认为，MOA、EOA是引起羊肉特殊风味的主要脂肪酸，而MNA变化范围较大，作用相对较小。同时，有关其风味阈值的研究也证实了上述研究的准确性，风味阈值是人们能够感知该物质气味的最小浓度，该值越小，表明其对风味的贡献程度越大，3 种支链脂肪酸在pH 2的介质中，EOA的风味阈值最低，为0.006 mg/kg，MOA的风味阈值居中，为0.02 mg/kg，MNA的风味阈值最大，为0.65 mg/kg[17]。本实验研究发现，小尾寒羊日粮中添加沙葱及其提取物，能够不同程度降低羊背部皮下脂肪、肾周脂肪和大网膜脂肪中4-烷基支链脂肪酸的含量。包志碧[18]研究发现，日粮中添加沙葱及其提取物，特别是脂溶性提取物，能显著降低羊背部皮下脂肪中致膻物质MOA、EOA和MNA的含量，从而改善羊肉风味。Liu Wangjing等[11]研究发现，舍饲肉羊日粮中添加11～22 mg/kg的沙葱黄酮能够显著降低羊肉肌内脂肪中MOA的含量，同时MNA含量也呈降低的趋势。以上研究结果进一步表明，沙葱及其提取物对羊肉膻味的减轻具有积极作用。

致膻物质4-烷基支链脂肪酸的合成通常有以下几条途径：第一，丙酸是合成支链脂肪酸的重要前体物，瘤胃微生物发酵谷类饲料中的淀粉产生大量丙酸。部分丙酸通过氧化和糖异生作用被机体利用，超过肝脏代谢能力的另一部分丙酸则转化为丙二酰辅酶A和琥珀酸的中间体甲基丙二酰辅酶A。研究发现丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A两者具有相互竞争和抑制的作用[19]，较高的丙二酰辅酶A脱羧酶活性会降低其组织局部可用性，从而使丙酸羧化形成的甲基丙二酰辅酶A的可用性成比例增加，因此，脂肪酸的从头合成可以用丙酸盐作为引物，生成奇数碳脂肪酸，以丙二酸甲酯作为延伸单元，生成支链脂肪酸。第二，瘤胃微生物可利用异丁酸、异戊酸及支链氨基酸，产生带有支链的碳骨架，微生物利用这些碳骨架合成支链脂肪酸，因此这些支链脂肪酸也是瘤胃微生物脂质构成的一部分，当微生物裂解死亡后，这些脂肪酸通过小肠吸收可直接沉积于脂肪组织中。但有学者提出，支链脂肪酸源于瘤胃微生物的说法有待商榷，因为在饲喂不同类型日粮后，非末端支链脂肪酸并没有出现在瘤胃微生物机体中[20]，因此推测支链脂肪酸是通过绵羊组织合成的。第三，4-烷基支链脂肪酸可能是羊体内更长链脂肪酸降解后的产物。综上所述，沙葱及其提取物降低脂肪组织（除尾部脂肪）中4-烷基支链脂肪酸的原因可能是，沙葱及其提取物中的活性成分能够抑制上述第1种途径中丙二酰辅酶A脱羧酶基因的表达，进而抑制其活性，避免脂肪酸合成底物中丙二酸辅酶A被该酶降解，因而降低甲基丙二酰辅酶A参与脂肪酸合成生成支链脂肪酸的概率。同时，瘤胃微生物合成支链脂肪酸，可能通过生物氢化作用将甘油三酯降解后的不饱和脂肪酸异构化为支链脂肪酸。研究表明，沙葱及其提取物中的生物活性成分具有较强的抗氧化活性[21-22]，因而能够阻滞瘤胃微生物的生物氢化作用，减少支链脂肪酸的产生。

本实验研究发现，小尾寒羊日粮中添加沙葱及其提取物对尾部脂肪4-烷基支链脂肪酸的沉积量没有显著影响，表明尾部脂肪组织4-烷基支链脂肪酸的合成与沉积不受日粮影响，推测在尾部脂肪可能存在一种特殊的脂肪代谢机制。达马拉肥尾羊尾部肥大，耐粗饲、耐寒冷，适合在草地成群牧养。研究表明，达马拉肥尾羊依靠其尾部，能够在营养供给不足等恶劣条件下动员尾部储存的脂肪维持机体能量需求，表明其尾部形成了独特的局部脂肪代谢机制；此外，达马拉肥尾羊尾部脂肪和腓肠肌中均含有高水平的非末端支链脂肪酸，但杜泊羊和美利奴羊在同一部位肌肉组织中并未检测出这类脂肪酸，进一步证明了达马拉肥尾羊尾部具有独特的脂肪代谢机制[23]。高纤维含量日粮的有效降解会导致瘤胃中高乙酸盐和低丙酸盐的形成，达马拉肥尾羊长期采食高纤维含量的粗饲料，可能导致其机体代谢丙酸的能力降低，出现较低的丙酸代谢阈值，由于肝脏的丙酸代谢速率降低，多余的丙酸可能被运送到尾部脂肪作为前体物合成支链脂肪酸。小尾寒羊同样具有耐粗饲、适应能力强的特点，因此推测其尾部脂肪可能也具有独特的局部脂肪代谢机制，使其脂肪酸的代谢不受日粮调控，但相关机理还需进一步验证。

3.2 肉羊各部位体脂4-烷基支链脂肪酸的沉积差异

从总体上看，本实验中外部脂肪，特别是尾部脂肪中4-烷基支链脂肪酸的沉积量平均值高于内脏脂肪（肾周脂肪和大网膜脂）；尾部脂肪中4-烷基支链脂肪酸沉积量平均值显著高于背部皮下脂肪；肾周脂肪中支链脂肪酸的沉积量平均值略大于大网膜脂肪，差异不显著。造成4-烷基支链脂肪酸在肉羊不同部位脂肪组织沉积量差异的原因可能是，脂肪酸的从头合成和外源脂肪酸的摄取这2 种脂肪酸沉积方式在不同脂肪组织间的影响不同。Berthelot等[24]研究发现，日粮中添加丙酸盐以模拟高谷物比例日粮能够改变绵羊脂肪组织中甲基支链脂肪酸的组成，且皮下脂肪组织中甲基支链脂肪酸的沉积量显著高于内脏脂肪组织。Johnson等[25]的研究结果同样证实这一点，其发现绵羊皮下脂肪中MOA的沉积量显著高于内部脂肪，且饲喂不同类型日粮的绵羊其肾周脂肪中MOA的沉积量均低于其他部位脂肪组织，这与本实验结果相一致，造成这一现象可能的原因是由于丙酸盐是奇数碳脂肪酸和甲基支链脂肪酸的重要前体物，背部皮下脂肪可能对日粮中丙酸盐的增加更为敏感，相比其他脂肪组织具有更高的丙酸利用能力；因此皮下脂肪会沉积更多的支链脂肪酸。Resconi等[26]研究报道，放牧饲养条件下，绵羊背部皮下脂肪中MOA的沉积量显著高于内脏脂肪，且内脏脂肪中大网膜脂肪和肾周脂肪中的MOA沉积量也存在显著差异，这与本实验结果不同，可能原因是两者的饲养条件不同，本实验的饲养条件为舍饲。有研究表明，反刍动物在天然放牧时的行为习性和采食远比舍饲时复杂、丰富，在不同饲养模式下，反刍动物乳、肉产品的风味也有所不同[27]。

不饱和脂肪酸、支链脂肪酸和奇数碳脂肪酸含量被认为是降低羊肉脂肪熔点的主要影响因素，且羊皮下脂肪的化学分析结果显示，大量的奇数碳脂肪酸和甲基支链脂肪酸有助于降低脂肪的熔点[16]。事实上，在反刍动物机体中外部脂肪的熔点低于内脏脂肪的熔点，直观特征就是外部脂肪组织质地较为柔软，尾部脂肪表现更为明显，即尾部脂肪的熔点较内脏脂肪的熔点低，本实验尾部脂肪中支链脂肪酸的含量显著高于内脏脂肪（肾周脂肪和大网膜脂），这也间接证实了上述研究结果。另外，Smith[28]报道在一些动物的哈德氏腺、睑板腺和尾脂腺中甲基支链脂肪酸是脂肪酸合成酶的主要产物，推测禽类尾脂腺中甲基支链脂肪酸的高沉积是由于存在高活性丙二酰辅酶A去羧化酶，降低了丙二酰辅酶A的局部可用性而产生的，从而导致丙酸羧化形成的甲基丙二酰辅酶A作为脂肪酸链延伸底物的可用性成比例增加。综上，甲基支链脂肪酸的合成具有组织特异性，结合本实验结果推测，肉羊尾部脂肪可能具有合成支链脂肪酸的组织特异性。

肉羊脂肪组织中MOA、EOA和MNA这3 种4-烷基支链脂肪酸的定量检测对羊肉风味的调控至关重要。Kaffarnik等[7]研究报道，美利奴羊、法国伊尔羊与美利奴羊和新西兰羊杂交羊3 个品种皮下脂肪组织中MOA的平均沉积量为23～88 μg/g、EOA的平均沉积量为13～26 μg/g、MNA的平均沉积量为2.9～18 μg/g，其中MOA含量相对较高，MNA的含量相对较低。Watkins等[29]也有类似的报道，该研究发现MOA在澳大利亚绵羊皮下脂肪支链脂肪酸中含量最为丰富，MOA含量几乎是EOA含量的2 倍，是MNA含量的10 倍；同时，该研究还发现，肉羊品种不同，3 种支链脂肪的比值可能存在差异，该比值可作为一种有效的潜在预测指标用于鉴别不同产地、不同品种的肉羊；背部皮下脂肪3 种支链脂肪酸的相关性分析结果表明，EOA与MNA间无相关性（r＝0.18），而MOA与EOA（r＝0.64，P＜0.05）和MNA（r＝0.72，P＜0.05）显著相关。以上研究与本实验结果略有不同，可能原因是采样部位的不同，本实验采样部位是第6～7腰椎肌肉上方的脂肪组织，而上述实验采样部位是臀中肌上方的脂肪组织，且所用统计方法不同，本实验采用Spearman相关性分析方法，上述实验采用Pearson相关性分析方法，因而在膻味物质的相关系数和P值上有所差别。MNA在水中的风味阈值是MOA的30 倍[30]，因此MNA被认为在羊肉风味形成中的贡献较小，但值得注意的是，3 种支链脂肪酸共同存在可能对羊肉风味的形成产生叠加效应[31]，虽然MNA在脂肪组织中的沉积量最低，但与其他2 种支链脂肪酸的共同作用可能会给绵羊风味带来微妙变化。

综上所述，沙葱及其提取物能够不同程度降低肉羊背部皮下脂肪、肾周脂肪和大网膜脂肪组织中4-烷基支链脂肪酸的沉积，降低膻味，从而改善肉羊体脂风味。