刘朝阳，赵 方，栾大伟，李雅慧，刘 萍，卢晋英

1.博奥赛斯(天津)生物科技有限公司，天津 300300;2.天津市化学发光与快速诊断分析技术企业重点实验室，天津 300300;3.天津市第三中心医院，天津 300000

近年来，肝纤维化日益受到人们的重视，已成为肝病研究领域的热点。诸多病因如病毒、乙醇、药物等所致的肝细胞炎症、坏死均可引起肝纤维化。肝纤维化为慢性肝病发展至肝硬化过程中的病理组织学变化，是发展到肝硬化的必经阶段[1]。其疾病过程为：慢性肝病-肝纤维化-肝硬化-肝癌。研究认为肝纤维化尚有逆转至正常肝的可能，而肝硬化则不能[2-3]。所以，肝纤维化在一定条件下可被逆转，早期发现、阻断肝纤维化对治疗慢性肝病十分重要[4]。

层粘连蛋白(LN)是细胞间外间质(ECM)中的非胶原糖蛋白，大量沉积于基质膜的透明层[5-6]。在肝纤维化发生过程中，患者细胞外基质的代谢产物可释放到人体血液之中，LN即为该种代谢产物，研究发现其可作为非酒精性脂肪肝、肝癌等肝脏疾病中肝纤维化的血清学标志物[7-11]。本研究旨在建立一种LN荧光免疫检测方法，用于定量检测人血清LN水平，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取天津市三中心医院肝纤维化和肝硬化患者的血清标本，溶血、黄疸、脂血等标本剔除。标本血清为空腹静脉采血，分离出血清立即用于分析，可于4 ℃冰箱中保存，长期存放应保存在-20 ℃以下，并避免反复冻融。

1.2仪器与试剂 喷金划线仪HM3030、宽型切条机CM3020、微电脑斩切机，荧光免疫分析仪P200为博奥赛斯(天津)生物科技有限公司研制生产。LN化学发光检测试剂由博奥赛斯(天津)生物科技有限公司提供。荧光微球购自Thermo公司，链霉亲和素购自Sigma公司，硝酸纤维素膜(NC膜)购自PALL公司，其他试剂均为国产分析纯。LN抗原、抗体均购于梅迪赛斯生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1LN固相抗体制备 分别将LN抗体及链霉亲和素配置成一定浓度的溶液，使用喷金划线仪分别包被在NC膜的检测区和质控区，37 ℃干燥后密封室温保存备用。

包被浓度的选择试验方法：分别选用以下3种缓冲液稀释LN抗体及链霉亲和素进行包被，测定其包被效果。缓冲液1#：pH8.0，缓冲液2#：pH6.4，缓冲液3#：pH7.2。

1.3.2荧光标记抗体制备 取0.10 mL荧光微球，清洗1次(0.10 mol/L硼酸盐缓冲液)加入0.12 mg/mL的活化剂可溶于水的碳二亚胺(EDC)，混匀，加入LN抗体至100.00 μg/mL。交联4 h，加牛血清清蛋白(BSA)至20.00 μg/mL，封闭过夜，4 ℃保存备用。

荧光标记抗体稀释比例选择试验方法：LN抗体微球分别以1∶30、1∶50、1∶100比例稀释，测定其效果。

1.3.3层析时间的选择 比较层析12、15、18 min不同时间下对试验结果的影响。

1.3.4试剂盒的组装 将吸水纸、NC膜、样品垫按顺序粘贴组成试剂板，用斩切机将试剂板分切成(4.0±0.2)mm的试剂条。将试剂条装入卡中扣合，即为完整检测卡。

1.3.5检测缓冲液配置 LN荧光标记抗体终浓度以1/100，质控荧光标记抗体浓度以1/500，其他以稀释液补充，配置检测缓冲液。

1.4荧光免疫层析分析

1.4.2精密度 抽取3个批次的LN检测卡，选取高值和低值标本分别重复测试各10次，进行精密度检测。计算批内变异系数(CV)与批间CV，可得出检测卡的精密度数据。

1.4.3线性试验 将接近线性范围上限的高值标本按一定比例稀释为5种浓度，其低值浓度的标本需接近线性范围下限，使用LN测定试剂盒(荧光免疫层析法)测定，每一种浓度重复测定3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数(r)。r≥0.990 0判定为符合标准。

1.4.4准确度 准确度以回收试验来评估。取LN的临床检测高值标本，与低值标本以1.0∶9.0的体积比例混合，测试高值标本、低值标本与混合标本的实际浓度值，各平行测定3次取均值。

回收率=(混合标本测值×10-低值标本测值×9)/高值标本测值

1.4.5钩状效应(Hook效应) 用灭活的小牛血清作稀释液，将LN高值校准品配置成一系列浓度，平行测定每种浓度校准品两次荧光强度值，取其均值。

1.4.6对比试验 与市售LN检测试剂盒(化学发光法)平行检测100份临床血清标本，记录结果，计算相关性。市售LN检测试剂盒按照其说明书进行检测操作。

1.5统计学处理 采用2010版本Excel进行趋势分析，采用SPSS20.0对检测结果进行统计分析。

2 结 果

2.1方法学建立

2.1.1包被浓度的选择 随标本浓度值的升高，测试所得T/C值随之升高，缓冲液1#测试结果与标本相关性较好，选择缓冲液1#。见图1。

图1 包被浓度的选择

2.1.2荧光标记抗体稀释比例的选择 LN抗体微球稀释实验结果显示，1∶50比例稀释的检测缓冲液，随标本浓度值的升高，测试所得T/C值随之升高，1∶30比例稀释的检测缓冲液测试T/C值偏高，表明LN抗体微球浓度偏高。综合考虑，以1∶50为基础稀释比例。见图2。

图2 荧光标记抗体稀释比例的选择

2.1.3层析时间的选择 层析时间试验结果显示，20 ng/mL标本在7.5 min后测值已经稳定，100 ng/mL标本在10 min后测值趋于稳定，800 ng/mL标本在12.5 min后较稳定。CV结果显示，层析12 min标本CV>10.00%，15、18 minCV均<10.00%；综合以上，同时考虑时间效率因素，选择层析时间为15 min。见图3、表1。

图3 层析时间的选择

表1 不同层析时间的标本CV(%)

2.2方法学验证

2.2.1灵敏度 LN检测卡的空白限分别为3.35、3.27、4.22 ng/mL，符合行业标准。见表2。

表2 空白限试验结果

2.2.2精密度 经过3个批次的CV测试，可得出3批LN检测卡的低值批内精密度分别为6.12%、3.18%、6.08%，高值标本批内精密度分别为6.51%、4.74%、5.21%，选取最大值6.51%为本检测试剂盒的批内精密度；高低值标本的批间精密度分别为5.87%、6.23%，选取最大值6.23%为本检测试剂盒的批间精密度。见表3。

表3 检测卡精密度分析

2.2.3线性 在20～800 ng/mL的线性范围内，LN检测卡的线性r为0.998 9。见表4、图4。

表4 线性试验结果(ng/mL)

2.2.4准确度 经过3批LN检测卡的回收率测试可知，回收率为86.03%～97.50%，产品重复性较好。见表5。

图4 拟合方程图

表5 检测卡回收率分析

2.2.5Hook效应分析 LN浓度从800 ng/mL升至8 000 ng/mL时，检测的荧光强度值随浓度增加而升高，没有出现Hook效应。见表6。

表6 Hook效应分析

2.2.6方法学比较 与化学发光LN试剂盒比对，检测100份临床标本，两种方法学的检测结果回归方程为Y=1.021 9X-1.172 0，r=0.987 1。见图5。

图5 两种试剂盒测定血清标本LN水平的相关性图

3 讨 论

LN属于细胞外基质成分，随着肝纤维化病情发展越来越严重，细胞外基质成分在血清的浓度会明显上升，因此对判断肝病和肝纤维化的严重程度具有重要价值。

本研究开发的LN测定试剂盒为荧光免疫分析测定系统，采用荧光示踪物标记抗原或抗体，与待测物进行一系列免疫反应，通过测定反应产物的荧光强度以分析待测物浓度。本研究结果显示荧光免疫分辨检测LN方法的回收率为86.03%～97.50%，空白限为4.22 ng/mL，线性范围为20～800 ng/mL，r=0.996 5；批内精密度为6.51%，批间精密度为6.23%。与市售LN试剂平行检测100份血清标本，有良好的相关性(Y=1.021 9X-1.172 0，r=0.987 1)。这表明本试剂盒测试重现性好，与市售试剂盒有良好的相关性。

时间分辨免疫测定荧光是目前应用非常广泛的微量分析技术之一[12-16]，具有专一性强、灵敏度高、实用性好、检测时间短、价格低廉等优点。时间分辨免疫层析以铕荧光微球为标记物，与传统荧光标记物相比，其有独特的荧光特性：荧光寿命长、stokes位移大、激发光谱和发射光谱无交叉、特征峰尖锐、标记物体积小、灵敏度高、可定量。该方法最快15 min出结果，可用于快速对大量患者的血清学标本进行检测。高通量的免疫学筛查无实验室限制，便于在二级及其以上医院快速推广。同时，基于LN检测试剂制备低成本的快检试剂，可以用于社区等基层医疗机构对就医人群进行快速、低成本的筛查，以便实现集中患者、集中资源、集中专家、集中收治，以及实现医疗资源的高效运转。

综上所述，本研究建立的LN荧光免疫分析检测方法符合临床检验需求，在临床检验中具备应用价值，值得推广使用。