刘 涛,李 晶,鲍翠玉

(湖北科技学院1. 附属第二医院、2. 糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

有研究报道，棕榈酸(palmitic acid，PA)通过上调内质网凋亡信号通路相关蛋白PERK、ATF4、CHOP表达水平诱导H9c2心肌细胞凋亡[1]。普伐他汀(pravastatin)属于他汀类调脂药物，可减轻心脏微血管内皮细胞氧化应激损伤，有效降低心血管疾病死亡率[2-3]，但pravastatin以何种途径参与心肌细胞脂毒性损伤的调控机制研究较少。本研究将探讨Pravastatin 对高脂造成心肌细胞凋亡的保护作用及其与内质网凋亡通路中PERK/ATF4/CHOP途径的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料H9c2心肌细胞系购于上海通派生物有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自维格拉斯生物技术公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT检测试剂盒购自众一生物科技有限公司；Pravastatin、PA购自美国Sigma公司；一抗购自英国abcam公司；二抗购自美国Abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1细胞增殖率检测 将盛有细胞的96孔板置于37 ℃二氧化碳培养箱24 h，待细胞贴壁后，根据实验设计，分组给药继续孵育。每孔加入20 mL MTT，孵育4 h。弃去孔内原液体，避光环境下，加入150 mL DMSO。在570 nm处检测OD值。

1.2.2ROS水平检测 向载有玻片的6孔板内加入细胞，在37 ℃二氧化碳培养箱内放置24 h，待细胞贴壁后，分组给药继续孵育，DMEM培养基洗涤2遍后，加入1 ∶500 ROS工作液，37 ℃，5% CO2培养箱内孵育20 min，PBS液洗涤3遍、加入适量DAPI，室温避光孵育10 min，洗涤封片后用荧光显微镜观察细胞内荧光。

1.2.3免疫印迹法检测 测定各组细胞裂解后蛋白浓度，在槽内加入每组蛋白样品，进行蛋白电泳、转模、封闭后，用下列一抗孵育过夜:GRP78、CHOP、p-PERK、PERK、ATF4、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。……