张安琪 安萌 姜博 唐文强 潘丽 付波

RNA 修饰在基因表达调控中发挥重要作用。在不同的生物学进程中，RNA 修饰是动态、可逆且广泛存在的。目前，已知的RNA 化学修饰达170 多种，RNA 修饰既可以发生在编码RNA 也可发生在非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），被称作“表观转录组”。其中甲基化是最主要的RNA 修饰之一，也是近年的研究热点。RNA 甲基化修饰主要包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）、假尿苷（pseudouridine，Ψ）和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修饰等。对于m5C 修饰，过往的研究主要集中于DNA，而RNA 中m5C 修饰的功能及调节机制的研究尚处于起步阶段。近年来，随着甲基化测序技术的发展，在编码RNA 及非编码RNA 中均证实了m5C 甲基化修饰的存在[1-3]。RNA m5C 甲基化修饰主要依赖于甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）及结合蛋白（readers）。RNA m5C 甲基化修饰发挥多种生物学功能，如调节mRNA 的转运、RNA 的稳定性、翻译、线粒体活性、压力应激等。近年来的研究表明，RNA m5C 甲基化修饰参与调节多种肿瘤的发生、发展及侵袭转移，如膀胱癌[3]、肝癌[4]、头颈鳞状细胞癌[5]、胶质瘤[6]等。本文综述RNA m5C 甲基化修饰的调控机制、功能以及在肿瘤中的研究进展。

1 RNA m5C 甲基化修饰的调节机制

RNA m5C 甲基化修饰是一个动态、可逆的过程，主要调节因子有3 个：m5C 甲基转移酶、去甲基化酶和m5C 甲基化结合蛋白。RNA m5C 甲基转移酶主要包含NOL1/NOP2/sun（NSUN）甲基转移酶和DNA 甲基转移酶类似物DNMT2，其催化形成5-甲基胞嘧啶。m5C 甲基化结合蛋白通过识别和结合m5C 甲基化位点来发挥作用，去甲基化酶催化RNA m5C 的去甲基化。

1.1 m5C 甲基转移酶

m5C 甲基转移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）作为甲基供体，将甲基转移至胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶。目前，已知的RNA m5C 甲基转移酶有10 余种，包括NSUN 家族、DNA甲基转移酶类似物DNMT2、tRNA 特异性甲基转移酶TRDMT 家族。

NSUN 家族蛋白含有Rossman 折叠催化结构域和1 个SAM 结合位点。NSUN 家族成员包括NSUN1-NSUN7。NSUN1 直接结合60～80 S 核糖体前体，催化人28S rRNA m5C 修饰。NSUN2 为研究最多的NSUN 家族成员。NSUN2 可以催化多种RNA的m5C 甲基化修饰，如rRNA、tRNA、mRNA、mt-RNA和病毒RNA 等。NSUN2 介导的m5C mRNA 广泛分布在所有的编码区。NSUN2 发挥多种生物学功能，如调节上皮细胞分化、HIV-1 转录、EB 病毒降解等。NSUN2 在多种肿瘤中高表达，介导肿瘤发生发展。如在胆囊癌中，NSUN2 沉默抑制胆囊癌细胞的增殖及肿瘤形成[7]。在肝癌中，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）H19 是NSUN2 的特异性靶标，m5C 修饰的H19 通过招募Ras-GTPase 激活蛋白结合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domainbinding protein 1，G3BP1）促进肝癌发生发展[8]。NSUN3 主要定位于线粒体，催化反密码子环中C34处线粒体编码的tRNA 甲硫氨酸（mttRNAMet）甲基化。NSUN4 是rRNA 特异性的甲基化转移酶，以N 端26个氨基酸基序依赖的方式转运至线粒体。NSUN4 与线粒体调节因子MTERF4 相互作用，募集到线粒体核糖体大亚基，通过甲基化修饰12S rRNA C911 位点，促进线粒体核糖体组装。NSUN5 定位于核仁，也是rRNA 特异性的甲基转移酶，催化25S rRNA 的Ⅳ结构域C2278 位点甲基化。在结直肠癌中，高表达的NSUN5 通过调节细胞周期促进肿瘤细胞的增殖[9]。NSUN6 部分存在于高尔基体和中心小体，是tRNA甲基化调节因子，催化C72 位tRNACys和tRNAThr甲基化，影响tRNA 生成。NSUN6 在肿瘤中表达下调，NSUN6 高表达与部分肿瘤预后较好相关[10]。NSUN7介导增强子RNA（enhancer RNA，eRNA）m5C 甲基化修饰。

DNMT2 具有DNA 甲基化酶的序列和结构特征，可以催化胞嘧啶DNA 甲基化。同时，DNMT2 也可以催化C38 位tRNAAsp甲基化。DNMT2 催化的tRNA 甲基化在tRNA 的加工、维持翻译准确性、稳定性和差异性中发挥重要作用，并可保护其免受核糖核酸酶的裂解。另有两种甲基转移酶，TRM4A 和TRM4B，可以特异性催化tRNA m5C 甲基化修饰。综上所述，甲基转移酶是RNA m5C 甲基化修饰重要调控因子之一，不同的甲基转移酶催化一种或多种RNA 的甲基化。尽管目前部分研究已证实甲基转移酶在部分肿瘤中发挥重要作用，但不同类型的甲基转移酶在不同肿瘤的发生发展中的作用及机制仍有待阐明。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶（ten-eleven translocation，TET）家族是依赖于Fe（Ⅱ）和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的双加氧酶，其家族成员包括TET1、TET2 和TET3，其中TET3 在细胞核和细胞质均有分布，而TET1 和TET2 多定位于细胞核。TET 酶家族可催化DNA 5-甲基-2'-脱氧胞苷（5-methyl-2'-deoxycytidine，5mdC）氧化形成5-羟甲基-2'-脱氧胞苷（5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine，5hmdC）、5-甲酰基-2'-脱氧胞苷（5-formyl-2' deoxycytidine，5fdC）和5-羧基-2'-脱氧胞苷（5-carboxyl-2'-deoxycytidine，5cadC）。TET 酶家族也可以作为RNA 去甲基酶，对编码RNA 和非编码RNA 中的5-甲基胞苷（5-methylcytidine，5mrC）及其氧化类似物均具有活性，包括5-羟甲基胞苷（5-hydroxymethylcytidine，5hmrC）、5-甲酰基胞苷（5-formylcytidine，5frC）和5-羧胞苷（5-carboxycytidine，5carC）。TET 酶家族对多种核酸底物包括dsDNA、ssDNA、ssRNA 和DNA-RNA 杂交链均可发挥催化作用[11]。但是对于TET 的结构和生物学功能以及如何增强TET 介导的氧化特异性和选择性等问题仍有待深入研究。

1.3 m5C 甲基化结合蛋白

RNA 修饰发挥的生物学功能主要与其结合蛋白相关。m5C 甲基化结合蛋白主要有ALYREF（ Aly/REF export factor） 和YBX1 （ Y-box binding protein 1）。ALYREF 是mRNA 转运蛋白复合体TREX 的主要组成部分。在mRNA 出核过程中，ALYREF 首先被募集，在CBP80 介导下与mRNA的5'端结合，在PABPN1 介导下与mRNA 的3'末端结合；ALYREF 还通过与3'端加工因子CstF64 直接作用，进一步加强ALYREF 和mRNA 的结合。在人HeLa 细胞和小鼠组织中，ALYREF 直接与mRNA m5C 位点结合，促进mRNA 核-质穿梭，而mRNAALYREF 的结合亲和力以及出核过程均由NSUN2介导。YBX1 是一种新发现的m5C 结合蛋白，YBX1可调节细胞质中mRNA 的稳定性。在膀胱癌中，YBX1 通过其冷休克结构域（cold-shock domain，CDS）中W65 位吲哚环识别m5C 修饰的mRNA 并与之结合，通过募集YBX1 互作因子（ELAV-like protein 1，ELAVL1），YBX1 可稳定m5C 修饰的mRNA 从而调节mRNA 代谢。在肺癌中，YBX1 通过与lncRNA LINC00312 直接结合促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和血管生成[12]。目前研究并发表的m5C 甲基化结合蛋白仅有ALYREF 和YBX1，其他甲基化结合蛋白仍待发现和验证，其对于RNA m5C 修饰的调控机制亦待进一步研究。

2 m5C 甲基化修饰对RNA 的影响

2.1 m5C 甲基化修饰对mRNA 的影响

mRNA 中存在大量的m5C 甲基化修饰，m5C 甲基化修饰对mRNA 功能的影响是近年来的研究热点。1）m5C 甲基化修饰影响mRNA 的翻译。近期研究表明[13]m5C 修饰与mRNA 翻译之间存在功能上的相互依赖性。在HeLa 细胞中，编码区的m5C 位点与mRNA 的翻译效率呈负相关。而另一项研究表明[14]，NSUN2 诱导的m5C 甲基化与METTL3/METTL14诱导的m6A 甲基化协同作用，介导p21 mRNA 3'-UTR（untranslated region）甲基化，增强p21 mRNA 的翻译效率。近期亦有研究发现[15]mRNA 编码区m5C修饰与翻译效率呈负相关，而3'-UTR 中的m5C 甲基化修饰与翻译效率则呈正相关；2）m5C 甲基化修饰影响mRNA 的转运。研究表明[16]m5C 修饰在富含CG碱基的区域及紧邻起始密码子下游富集，并在mRNA出核中发挥关键作用；3）m5C 甲基化修饰影响mRNA的稳定性。在膀胱癌中，YBX1 通过招募ELAVL1 增强m5C 修饰的mRNA 稳定性[3]。有研究发现[17]m5C修饰水平与mRNA 稳定性无关或呈负相关。因此，m5C 甲基化修饰对mRNA 稳定性的影响仍需进一步研究。

2.2 m5C 甲基化修饰对tRNA 的影响

m5C 甲基化修饰调节tRNA 的稳定性，调节细胞代谢，参与细胞应激。研究表明，NSUN2 和DNMT2介导的tRNA m5C 修饰可维持tRNA 稳定性并调节细胞代谢[13,17]。在人、小鼠和植物中，TRM4/NSUN2 介导的m5C 甲基化可防止tRNA 因氧化应激而降解。DNMT2 介导的tRNA 甲基化可保护其免受核酸内切酶作用，调节底物tRNAAsp-GTC和tRNAGly-GCC的稳定性。

2.3 m5C 甲基化修饰对rRNA 的影响

m5C 甲基化修饰调节rRNA 的稳定性，影响核糖体合成。在小亚基12S rRNA 中，m5C甲基转移酶NSUN4可使胞嘧啶911 甲基化（m5C911），并与MTERF4 形成复合体，确保仅有成熟大亚基和小亚基组装形成复合体。m5C2278 与G2288 甲基化缺失导致25S rRNA 结构变化。当细胞暴露于过氧化氢时，Rcm1/NSUN5 的缺失会导致25S rRNA C2278 附近序列折叠更松散，说明Rcm1/NSUN5 在氧化应激条件下对维持rRNA 的稳定发挥重要作用。

2.4 m5C 甲基化修饰对其他RNA 的影响

m5C 甲基化修饰对病毒RNA、lncRNA、环状RNA（circular RNA，circRNA）等也具有重要作用。病毒RNA 中存在大量m5C 甲基化修饰。研究表明DNMT2 介导的m5C 甲基化可稳定HIV-1 基因组RNA，保障其在宿主细胞中存活[18]。然而近期亦有研究发现m5C 修饰对病毒RNA 复制和稳定性有负面影响。NSUN1 与HIV-1 Tat 蛋白竞争催化HIV-1 TAR RNA5'-UTR 的甲基化，从而抑制了HIV-1 复制并促使其进入潜伏状态[19]。非编码RNA、lncRNA 和circRNA 中也存在大量的m5C修饰。LncRNA HOTAIR和XIST 染色质修饰复合物相互作用区或其附近的m5C 甲基化，可通过影响XIST 与染色质相关蛋白复合物PRC2 的结合来影响XIST 功能。在肝癌组织中lncRNA 和circRNA m5C 甲基化频率和甲基化基因的数量也显著多于癌旁组织，提示m5C 修饰在肝癌发生发展中可能发挥重要作用[1-2]。综上所述，m5C 修饰在多种RNA 中广泛存在且可能发挥重要功能。目前，m5C 修饰对RNA 的影响研究还比较少，对其认知尚存争议，仍有待进一步研究。

3 RNA m5C 修饰在肿瘤中的研究进展

3.1 m5C 甲基化修饰与肝癌

通过对比肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）及癌旁组织发现，HCC 中mRNA m5C 峰明显多于癌旁组织，且分布更为广泛[4]。除了编码RNA，HCC 组织中circRNA 和lncRNA m5C 甲基化频率和甲基化基因的数量也显著多于癌旁组织[1，2]。RNA m5C 修饰促进HCC 进展，m5C 调节因子NSUN4 和ALYREF 的升高与HCC 患者的不良预后负相关[20]。近期研究发现，在肝癌细胞HepG2 中，NSUN2 缺失抑制细胞的增殖及迁移[8]。转录组测序及亚硫酸盐测序（bisulfite sequencing，Bis-Seq）发现NSUN2 缺 失 后lncRNA H19 m5C 甲基化和基因表达显著降低。机制研究发现，lncRNA H19 是NSUN2 RNA 甲基修饰酶的特异靶点，m5C 修饰影响H19 的半衰期与稳定性，m5C 修饰的H19 可通过特异结合G3BP1 肿瘤蛋白促进肿瘤的发生和发展[8]。

3.2 m5C 甲基化修饰与膀胱癌

在膀胱癌中，癌组织和癌旁组织RNA Bis-Seq 发现在膀胱癌中存在高频m5C 甲基化，大多数m5C 甲基化位点存在于mRNA 中，且高甲基化mRNA 在致癌通路中显著富集。进一步研究表明，膀胱癌组织中NSUN2 和YBX1 表达异常升高，原癌基因肝素结合生长因子（heparin binding growth factor，HDGF） mRNA被NSUN2 甲基化，YBX1 通过与HDGF mRNAm5C甲基化位点结合并募集ELAVL1，维持HDGF mRNA稳定性，促进肿瘤发生。

3.3 m5C 甲基化修饰与胃肠癌

研究表明与癌旁组织相比，NSUN2 在胃癌中上调表达。体内外实验证实NSUN2 促进胃癌细胞的增殖及肿瘤发生。RNA 测序发现在胃癌中p57KIP2 为NSUN2 调控的下游靶标。机制上，NSUN2 的甲基转移酶活性及p57Kip2 mRNA 3'-UTR 区m5C 修饰破坏了p57Kip2 mRNA 的稳定性，从而促进胃癌发生[21]。m5C 甲基转移酶和结合蛋白在胃肠癌中表达上调，其高表达与患者生存率低显著相关。生物信息学分析发现，m5C 调节蛋白与ErbB/PI3K-Akt 信号通路密切相关，GSK3B 是m5C 调节蛋白的重要靶点[22]。

3.4 m5C 甲基化修饰与白血病

在白血病中，NSUN1 特异性与BRD4 相互作用，直接与RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA-pol-Ⅱ）CTD-S2P 结合，在5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-AZA）耐药的白血病细胞中形成独特的NSUN1/BRD4/RNA-pol-Ⅱ CTD-S2P 复合物，从而介导5-AZA抗性染色质结构的形成，造成白血病中的5-AZA 抵抗。而NSUN3 和DNMT2 则对5-AZA 敏感的白血病细胞表现出相反作用。在机制上，RNA 结合蛋白hnRNPK直接与m5C 甲基化转移酶NSUN3 和DNMT2、谱系决定转录因子GATA1 和SPI1/PU.1 以及CDK9/PTEFb 相互作用，并在新生RNA 处募集RNA-pol-Ⅱ形成独特的复合物，最终形成对5-AZA 敏感的染色质结构。比较5-AZA 耐药和5-AZA 敏感的白血病病骨髓样本发现，5-AZA 耐药的骨髓中m5C mRNA 明显高于5-AZA 敏感的骨髓样本。hnRNPK、NSUN1和BRD4 的表达水平与白血病病程相关，并参与5-AZA 耐药及肿瘤进展[23]。

3.5 m5C 甲基化修饰与胶质瘤

在胶质瘤中，不同临床病理特征的肿瘤RNA m5C 甲基转移酶表达不同。利用5 种m5C 甲基转移酶基因构建风险预测模型可以预测胶质瘤患者生存率及临床病理特征，Cox 回归分析结果显示模型预测风险评分是胶质瘤独立预后因素[6]。此外，在多形神经胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中，大部分miRNA 存在m5C 修饰， miRNA-181a-5p 甲基化修饰与GBM 患者的不良预后相关。机制上，经含DNMT3a 和AGO4 的复合物介导，miR-181a-5p 的m5C 甲基化修饰抑制miRNA-181a-5p/mRNA 双链的形成，导致其抑癌作用丧失[24]。

3.6 m5C 甲基化修饰与肺癌

在肺腺癌中，基于11 个m5C 调控因子，划分了两种m5C 甲基化修饰模式，其具有不同的肿瘤微环境免疫细胞浸润特征；建立m5C 甲基化修饰评分体系，结果表明在高评分组肺腺癌患者预后较好，而m5C 低评分组预后较差[25]。基于14 个m5C 相关的lncRNA 构建肺腺癌患者预后预测模型，结果显示高危组预后较低危组差，具有较高敏感性和特异性[26]。在肺鳞状细胞癌中，与正常肺组织相比，m5C 甲基化调控因子NSUN3、NSUN4 高表达，与患者预后不良相关[27]。

4 结语与展望

综上所述，编码RNA 及非编码RNA m5C 甲基化修饰参与了肿瘤的发生发展、侵袭转移、肿瘤耐药等进程。RNA m5C 修饰及m5C 调节因子在作为肿瘤诊断和（或）预后判断的标志物中也显示出了巨大的潜力。对RNA m5C 修饰的靶向干预也可能为肿瘤的治疗开辟新的方向。尽管如此，对RNA m5C 甲基化修饰的影响及调节机制的研究仍较浅显，m5C 甲基化修饰在肿瘤中的研究尚处于起步阶段，机制解析相关研究较少，研究涉及的肿瘤类型亦不够全面，上述问题均有待于进一步研究探索。