严娅娟，陈新利，杨涛，王留宝，吴晖

(昆明医科大学第一附属医院药剂科，云南 昆明 650032)

0 引言

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根。具有解肌退热，生津止渴，透疹等功效[1]。当前报道葛根的主要药效成分为黄酮类成分葛根素等[2]，此外葛根也含有活性多糖[3]，其多糖具有抗氧化[3]、抑菌[4]及降血糖[5]等活性，但相关活性较弱。为此，欲获得理想的活性多糖可通过对多糖分子进行一定的修饰[6]。化学修饰是多糖分子修饰方法中运用最广的一类方法，其中硫酸酯化最为常用。天然多糖因SO3-基团取代多糖分子中的羟基经硫酸酯化修饰后，其活性受理化性质改变而改变，甚至有新的活性出现，其中，增强抗肿瘤活性为新出现活性中最常见的。当前对硫酸酯化葛根多糖(PLP)的报道还未出现，因此本文首先采用氯磺酸-吡啶法修饰PLP，得到硫酸酯化葛根多糖(PLPs)，进而考察其抗氧化活性、抑制H22肿瘤细胞的增殖，对免疫器官作用及对血清中IL-2 及TNF-α含量的作用，为今后开发葛根多糖提供可靠的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

葛根多糖(按文献方法制得[3])；1,1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、还原型辅酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)购于上海Aladdin 试剂公司；四噻唑蓝(MTT，美国Amresco 公司)；IL-2 及TNF-α试剂盒(南京建成生物工程研究所)；H22细胞株(上海博谷生物科技有限公司)；无水乙醇、K2SO4、氯磺酸、氢氧化钠(NaOH)、吡啶、甲酰胺、BaCl2、三氯乙酸、二甲基亚砜(DMSO)等试剂均为分析纯。

实验动物：BALB/c 雄性小鼠，体重20±2g，购于中科院上海动物中心。

1.2 仪器

UV-3600 紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，501-A 型超级恒温器(上海实验仪器厂有限公司)，CHRIST 冻干机(德国 Marin Christ 公司)，VS-1300L-U 超净工作台(苏州安泰公司)，Nicolet IS 10 FT-IR 红外光谱仪(美国Nicolet 公司)。

2 实验方法

2.1 PLP 硫酸酯化衍生物制备及分析

按照参考文献方法进行硫酸酯化反应[7]：在配有冷凝管的50mL 三口烧瓶中装入25mL 吡啶，将三口烧瓶放置于冰浴里，将氯磺酸5.0mL 逐滴加入，并高速搅拌反应物，在滴加反应完成后，冰浴装置撤去，即得到酯化试剂。精密称取PLP500mg，溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中。使其充分溶解后加入酯化试剂中，反应过程中保持恒温水浴加热(65℃)，分别反应1.5、2 及2.5h，反应完成后再次放置于冰浴中冷却，加入4mol/L 的NaOH 溶液调节pH 至中性，浓缩进行反应物，加入4 倍量无水乙醇沉淀，离心(4000 r/min，30min)，沉淀物用乙醇洗涤3 次，加10mL 水溶解沉淀物，透析，浓缩，冷冻干燥，得到3 个葛根多糖硫酸酯化产物PLPs(PLPs1、PLPs2及PLPs3)，进行红外扫描(4000-400cm-1)。

PLPs 中硫酸根含量采用氯化钡-明胶法测定；硫酸基的取代度(DS)按下式计算：

式中，w 为硫的质量分数。

2.2 PLPs 体外抗氧化实验

2.2.1 多糖对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除作用

式中：A0为对照实验(水代替PLP、维生素C 溶液)的吸光度；A1为样品实验的吸光度；A2为样品干扰实验(0.1M pH=7.4磷酸盐缓冲液代替NBT 溶液)的吸光度。

2.2.2 多糖对羟基自由基(·OH)的清除作用

于试管中加入不同浓度的PLP 样品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及维生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0mg/mL)溶液1.0mL，分别加入2.4mL 磷酸盐缓冲液(0.1M pH=7.4)和0.6mL H2O2 溶液(40 mmol/L)。将反应体系混合均匀，10min 后测吸光度于分光光度计230 nm 处，PLP、维生素C 溶液和H2O2 溶液用水代替，作空白实验调零用。每个试样做3 次平行试验取平均值，清除率计算公式同以上式2。

2.2.3 多糖对1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除作用

于试管中加入不同浓度的PLP 样品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及维生素C溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0 mg/mL) 1.0mL，分别加入0.2mL DPPH 溶液(0.4mmol/L)，再加入2.0mL 水。将反应体系混合均匀，30 min 后测吸光度于波长517 nm 处。用无水乙醇配制DPPH 溶液。PLP、维生素C 溶液用水代替，DPPH溶液用无水乙醇代替，作空白实验调零用。每个试样做3 次平行试验取平均值。清除率计算公式同以上式2。

2.3 PLPs 体内抑制H22 肿瘤细胞增殖实验

从H22荷瘤小鼠腹腔中抽取肿瘤细胞液，用生理盐水调节其细胞密度至1×106个/mL，台酚蓝试剂进行染色，于显微镜下观察，细胞存活率不小于95%。取洁净级BALB/c 的无菌雄性小鼠(20±2g)，右腹股沟皮下植入0.1mL 瘤细胞悬液。植入后，小鼠饮食自由。24 h 后，将小鼠进行随机分组：模型组(0.9% NaCl)；阳性对照组(Cyclophosphamide，Cy，30mg/kg)；PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3高、低剂量组(200、100 mg/kg)，每组10 只。每天用相应药物灌胃一次，10 天后称取重量，将小鼠处死，各组于小鼠眼眶静脉丛取血，离心，并分离血清，按试剂盒说明书指导操作，计算血清中TNF-α和IL-2含量。同时称量肿瘤、脾脏及胸腺重量。计算肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数。

Wc 为对照组平均肿瘤重量，Wt 为实验组平均肿瘤重量。

“江涵秋色碧潭潭，饮马胡儿不敢南。”秋高气爽之时，站在饮马河古渡口，看大河茫茫，奔流而下，历史的慷慨激昂如在眼前。是谁让我与这样一条大河相伴，一生它都会在我梦里奔流不息。曾几何时，两岸葱翠的柳条边，被砍伐殆尽，日夜轰鸣的抽沙船，搅动着它的安宁，超载的运沙车，碾压着坎坷的路面往来穿梭……每次路过长吉公路北线胜利桥时，看着千疮百孔的河道和不复清澈的河水，我的内心，都如失群的孤鸟般不停地哀泣。

2.4 统计学方法

将所有实验数据用Excel 建立数据库，运用SPSS 18.0 统计软件进行处理，计量资料所有数据均以±s 表示，组间样本均数差异比较选用T 检验，以α=0.05 为检验水准。

3 结果与分析

3.1 PLPs 硫酸基取代度

PLP 及PLPs 硫含量及取代度见表1，红外光谱图见图1。由图1 可知，C-O-S 的拉伸振动为822 cm-1处的吸收峰，这是硫酸酯键的特征吸收峰，表明多糖链上已连接了硫酸基团。且PLPs3在此处的吸收峰强度高于PLPs1及PLPs2，说明PLPs3中硫酸基含量最高[9]。

由表1 可知，多糖硫含量受硫酸酯化影响而明显增加；硫酸基含量受不同反应时间的PLPs 衍生物随着反应时间增加的影响而增加、取代度也随之增大。且有研究表明，硫酸酯化多糖的抗肿瘤活性受硫含量与DS 值大小的直接影响，一般认为DS 介于0.8～1.7 之间均具有良好的抗肿瘤活性[10]，取代度位0.88～1.60 之间的PLPs，按理应该具有良好的抗肿瘤活性。

表1 葛根多糖硫含量及取代度

3.2 PLP 抗氧化实验

3.2.1 PLPs 对超氧阴离子自由基清除活性的影响

不同浓度的PLPs 对超氧阴离子自由基的清除作用结果见图2。由图2 可知，PLP 及硫酸化衍生物 PLP s1、PLP s2、PLP s3对O2-自由基清除活性呈一定的量效关系。PLP-3 清除O2-活性稍高于PLP、PLP s1及PLP s2，但都弱于Vc。

图1 PLP 红外光谱

表2 PLPs 对H22 荷瘤小鼠肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数的影响

图2 葛根多糖及其硫酸化组分清除O2-活性

3.2.2 PLPs 对羟基自由基清除活性的影响

不同浓度的PLP 对羟基自由基的清除作用结果见图3。PLP 及PLPs 对·OH 自由基具有明显的清除活性。其中，PLPs3清除·OH 自由基活性效果最强，当其浓度达到3.0 mg/mL 时，其清除率为65.6%。

图3 葛根多糖及其硫酸化组分清除·OH 活性

3.2.3 PLPs 对DPPH·基自由基清除活性的影响

不同浓度的PLP 对DPPH·自由基的清除作用结果见图4，图4 表明PLP 及PLPs 对DPPH·自由基清除活性不一，但均具有清除活性。PLPs1对DPPH·自由基的清除作用效果为最弱，PLPs3清除活性最强。

图4 葛根多糖及其硫酸化组分清除DPPH·活性

3.3 PLPs 体内抗H22 肿瘤细胞增殖活性

表2 结果表明，PLP 及PLPs 均能抑制H22荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖，但其活性均没有环磷酰胺(Cy)好；未经修饰的PLP 活性均不如3 个硫酸酯化衍生物PLPs，且其活性与取代度具有一定相关性。环磷酰胺虽然抗肿瘤活性较好，却会显著抑制免疫器官的作用，因而往往致使用者免疫力低下[11]。而PLP 及PLPs 均能较好提高免疫器官指数，从而可使使用者免疫能力得到改善。

3.4 PLPs 对H22 荷瘤小鼠血清TNF-α 及IL-2 含量的影响

如表2 所示，与模型组比较，阳性对照组、PLP 高剂量组及PLPs 各剂量组对荷瘤小鼠体内TNF-α及IL-2 含量均均有显著性提高作用，其作用趋势与H22肿瘤抑制率成一定关联性。

4 小结与讨论

本研究表明天然葛根多糖虽具有一定抗肿瘤活性，但其活性不佳；经硫酸酯化修饰后可显著提高其抗肿瘤活性，且PLPs因硫酸基取代度的不同，其活性亦有一定差别。通过对本实验中3 个不同取代度的PLPs 抗肿瘤活性的比较可知，PLPs 活性的高取代度优于PLPs 活性的低取代度，但取代度之间的关联性和相关范围还需进一步研究得到证实。

机体重要免疫器官-胸腺及脾脏指数受PLP 及PLPs 影响均能得到改善，胸腺发挥免疫作用是通过产生T 淋巴细胞以及胸腺素；脾脏与体液免疫关系密切[12]；另外，H22荷瘤小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量受PLP 及PLPs 影响而增加，IL-2 通过调节机体的免疫系统发挥抗癌活性[13]，因此，增强机体免疫机能从而发挥抗肿瘤作用可能为PLPs 抗肿瘤作用机制之一。荷瘤小鼠血清中具有强烈杀伤肿瘤细胞的TNF-α含量受PLPs 影响作用而增加，说明PLPs 亦通过促进TNF-α的释放而发挥抗肿瘤作用。