温军业 张曼 范晓燕 陈旭光

T淋巴细胞(T lymphocyte)亚群的功能，在恶性肿瘤、血液系统疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病中发挥着积极的重要作用[1]。在多种恶性肿瘤(如乳腺恶性肿瘤、胃恶性肿瘤、肝恶性肿瘤、食管恶性肿瘤、肠道恶性肿瘤)患者的外周血或肿瘤组织中，CD4+T 细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值与患者的肿瘤分化程度、生存及预后密切相关[2,3]。因此，研究T淋巴细胞亚群的数量、分类及功能对于了解患者是否患有恶性肿瘤、免疫疾病、功能缺陷、感染性疾病及血液系统疾病等具有重要的意义。另外，其数值及变化规律对临床诊疗、病情监测和预后具有较好的临床指导价值。然而，动态监测荷瘤小鼠不同时期T细胞的变化过程，特别是初始T细胞的变化及作用机制，这方面的研究相对较少。本研究通过使用流式细胞技术，对荷瘤小鼠不同时期脾脏T细胞亚群水平进行动态监测，其数值的变化规律，可以有效的对荷瘤小鼠进行病情监测、判断其免疫状态及预后。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 实验小鼠均为C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，为雌性健康小鼠，购自河北省实验动物中心(许可证编号：SCXK冀2013-0051)，饲养于河北省实验动物中心(SPF级动物实验室，动物饲料及垫料均经放射线照射灭菌。实验室许可证号：SYXK(冀)2013-1-003)。饲养条件为：温度24℃～26℃，高效过滤器每5分钟换气1次，湿度40%～60%，每日保持12 h光照、12 h黑暗，交替进行。选取120只健康小鼠，挑选6只正常小鼠，为无瘤组，测其无瘤状态(Normal)的各项T淋巴细胞数值；其余小鼠随机分成2组，每组57只，A组为荷瘤组，B组为对照组。所有分组小鼠背部毛发都用备皮刀去除，去毛面积约为4 cm2，75%乙醇消毒小鼠背部颈后区域皮肤。

1.2 药品与试剂 黑色素瘤B16细胞由中国医学科学院上海细胞库提供，活细胞数至少占总细胞数的96%，培养于保湿箱中(37.0℃，5% CO2)，培养液中培养(含10%灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI-1640)。

1.3 动物模型 (1)无瘤组，去除毛发及消毒后，不做任何注射处理。(2)A组荷瘤组，取浓度调节好的瘤细胞悬液0.2 ml接种于荷瘤组(A组)小鼠背部颈后皮下区域。(3)B组对照组，小鼠背部颈后皮下区域注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 黑色素瘤细胞液制备：将对数生长期的黑色素瘤细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，PBS洗涤2次，浓度控制在5×106/ml。

1.4.2 黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立：黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立成功的条件为皮下植瘤后7～9 d，小鼠背部颈后皮下区域可及直径约2 mm左右质硬黑色结节，不能活动，界限清楚，视为建模成功。观察荷瘤组(A组)小鼠出瘤情况，出瘤当天(D0)从荷瘤组(A组)中，随机选取5只用于测量绘制荷瘤曲线，剩余荷瘤组(A组)出瘤小鼠及对照组(B组)小鼠自出瘤当天(D0)开始，每隔5天随机选出6只小鼠，分别处死、取出脾脏、流式仪行流式细胞学检测，得到CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例，至荷瘤组(A组)剩余小鼠中出现半数以上死亡时终止试验观察。

1.4.3 小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备：将小鼠脱颈处死，乙醇浸泡5 min，逐层切开小鼠腹壁，暴露脾脏，无菌分离脾脏，将脾脏放于盛有Hank’s液的灭菌EP管中剪碎，然后准备好200目无菌不锈钢细胞筛网，下置无菌培养皿。无菌吸管吸出剪碎的脾脏组织，置于不锈钢细胞筛网上，玻璃无菌注射器针芯研磨，培养基冲洗收集细胞，然后添加红细胞裂解液裂解2 min，加入0.9%氯化钠溶液10 ml以终止裂解，Hank’s液洗涤细胞2次，1 200 r/min离心10 min，弃去上清液，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬，计数。

1.4.4 流式细胞学检测：应用FACS Calibur流式细胞仪进行脾脏淋巴细胞检测。

2 结果

2.1 黑色素瘤B16细胞初期和中期的生长比较 在显微镜下观察黑色素瘤的培养过程，细胞培养3 d后，可于无菌培养瓶底见树突状细胞贴与其上，呈片状细胞团，不能活动；培养7～8 d后，细胞铺满瓶底，胰酶消化后细胞收缩成颗粒、球状、可活动的细胞。见图1。

培养3d后 培养7～8d后

2.2 时间对小鼠肿瘤生长体积的影响 种植肿瘤前(正常)，背部硫化钠脱毛处理，以便观察及种植；肿瘤生长阶段可以分为四个阶段。第一阶段：D0～D9,平缓发展阶段；第二阶段：D9～D17缓慢增长阶段；第三阶段：D17～D27加速度增长阶段；第四阶段：D27，小鼠致死阶段。荷瘤当天(D0)，小鼠背部无明显变化，小鼠背部可见直径约2 mm黑斑状，表面平坦、无隆起，小鼠活动无异常；荷瘤第5天(D5)，小鼠背部可见黑色肿瘤突出表面，直径3～5 mm，小鼠活动无异常；荷瘤第10天(D10)，黑色肿瘤生长较快，直径增大至约10 mm，活动略显笨拙；荷瘤第15天(D15)，肿瘤增大至15 mm，行动缓慢；荷瘤第20天(D20)，肿瘤增大至25 mm，较前更加缓慢；荷瘤第25天(D25)，肿瘤长径增大至约33 mm，小鼠目光呆滞、行动极其缓慢，走路来回晃动，不平衡，精神萎靡、背部皮肤可见转移结节，表面溃破、渗液、出血，并有血痂形成。见图2。

图2 小鼠肿瘤生长曲线

2.3 时间对CD3+T、CD4+T、CD8+T及初始T细胞值的影响

2.3.1 无瘤状态的各项指标与荷瘤组A组以及对照组B组的D0的数值几乎接近。荷瘤组和对照组，在D5、D10、D15、D20、D25时，小鼠脾脏CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例及CD4+/CD8+差异均有统计学意义(P<0.05)；而D0时各指标在2组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2 荷瘤组中， CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例及CD4+/CD8+的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25差异均有统计学意义(P<0.05)，且随时间延长而逐渐下降。

2.3.3 对照组中，CD8+T的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25间无统计学差异(P>0.05)；CD3+T、CD4+T、初始T细胞的比例及CD4+/CD8+在D0、D5、D10、D15间差异均无统计学意义(P>0.05)，从D20开始显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3.4 随着时间的延长，D0-D25，荷瘤组和对照组，所有指标CD3+T、CD4+T、初始T细胞以及CD4+/CD8+的比值均呈下降趋势。从D5开始，所有指标显示，荷瘤组比对照组下降得更快。见图3，表1、2。

图3 CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中的比例及CD4+/CD8+数值随时间的变化

表1 小鼠无瘤状态(Normal)各项T淋巴细胞的数值

表2 CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例(%)随时间的变化

2.4 小鼠不同时期的流式细胞图分析 荷瘤组(A组)中，CD4+/CD8+的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25之间差异均有统计学意义(P<0.05)，且随时间延长而逐渐下降；对照组(B组)中，CD4+/CD8+在D0、D5、D10、D15间差异均无统计学意义(P>0.05)，从D20开始显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；对于荷瘤组和对照组小鼠，随着时间的延长，从D5至D25，CD4+/CD8+的比值均呈下降趋势，且下降幅度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图4。

表4 不同时期CD4+/CD8+T数值的变化

图4 黑色素瘤小鼠不同时期的流式细胞图；A：CD3+C；B：CD4+T；C：CD8+T；D：初始T细胞

3 讨论

T细胞亚群主要包括CD4+T 细胞与 CD8+T 细胞。CD8+T是T淋巴细胞的一个亚群，活化后分化为CD8+的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)，辅助T细胞受体识别抗原并参与活化信号转导，能识别肿瘤细胞，可以破坏靶细胞的膜和细胞核而起到特异性杀伤肿瘤细胞的作用，是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。CD4+T 细胞是表达CD4抗原的T淋巴细胞，主要功能是辅助CD8阳性的T淋巴细胞，具有不同功能的细胞群，活化的 CD4+T 细胞可以分为 CD4+的辅助性T细胞和 CD4+CD25+的调节性T 细胞(T regulatory cell，Treg)。研究表明，CD4+的辅助性T细胞，如Th1、Th2 和 Th17细胞均具抗肿瘤免疫功能，可经过一系列过程可激活CTL，进一步杀伤肿瘤细胞[2,4]；而CD4+CD25+Treg 细胞是一种免疫抑制细胞，最多时约占正常人CD4+T细胞的10%，能特异性抑制CD8+CTL和非特异性抑制NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用，具有免疫抑制性和免疫无能性，降低肿瘤免疫治疗的效果，起肿瘤免疫逃逸作用，促进肿瘤的发生及发展[5]；CD8+T 细胞的活化部分依赖于CD4+T细胞，二者之间的平衡维持着机体正常的免疫应答。初始T细胞是已离开胸腺、但尚未受到其他抗原刺激的T淋巴细胞，它通过在血液和周围淋巴器官(脾、淋巴结)之间的再次循环，起执行免疫监视的功能。

本研究以黑色素瘤小鼠及正常小鼠为研究对象，采用流式细胞术动态监测T淋巴细胞亚群的变化，结果表明，荷瘤组小鼠CD3+T、CD4+T细胞水平和CD4+/CD8+降低，与刘夏青等[6-8]学者研究结果一致，与Cao等[9]研究结果不一致，其中，CD4+/CD8+T值的下降提示T 细胞亚群的紊乱，机体免疫力受到损伤，免疫状态失衡[3]；荷瘤组小鼠CD8+T细胞水平降低，揭示荷瘤小鼠对肿瘤细胞的杀伤作用较差，与肖体先等[10]学者的研究结果一致；与刘夏青等[6,11,12]研究结果不一致。可能有以下结果可能：(1)机体中CD4+T的低水平导致大量CD8+T细胞没有活化；(2)肿瘤恶性程度较高，荷瘤小鼠产生免疫耐受，导致 CD8+T 细胞表达降低[13]；(3)肿瘤微环境中趋化因子水平较低，浸润的CD8+T细胞数量下降[14]。荷瘤组小鼠初始T细胞水平降低。对于对照组，正常小鼠在前期生长过程中，T细胞亚群未发生变化，而在后期(从荷瘤第20天开始)，CD3+T、CD4+T、初始T细胞的比例及CD4+/CD8+均开始显著下降，考虑与老鼠胸腺功能下降、免疫力下降有关。

本研究发现，从D5开始，所有指标均显示，荷瘤组比对照组下降的更快，说明病程发展较迅速，其中D5-D10阶段是病程发展的转折点，可视为临床上加强治疗和用药的关键性契机。因此，监测恶性肿瘤状态、感染性疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病患者的免疫功能，尤其是T淋巴细胞免疫功能的状态及功能，对疾病的判断、疗效、病情监测、预后评估等均具有积极意义，随着分子生物学和免疫学的发展，细胞免疫治疗会成为肿瘤等疾病治疗研究的热点[11,15-20]。