变应性鼻炎免疫治疗的研究进展

2021-03-26刘蓉蓉聂丽华综述审校

检验医学与临床 2021年21期

刘蓉蓉，聂丽华综述，杨欣审校

重庆北部宽仁医院耳鼻喉科，重庆 401120

变应性鼻炎(AR)为临床常见疾病，患者以鼻痒、阵发性喷嚏、多清涕、鼻阻为主要临床表现，可合并变应性结膜炎、变应性哮喘等多种疾病，严重影响患者生活质量，甚至危及生命。目前临床治疗手段非常有限，以药物控制为主，但难以解决部分患者疗效不佳及停药后复发问题。免疫治疗是在探讨AR发病机制的基础上，力图阻断变态反应病理机制中的一个或多个有效环节，从而发挥治疗作用。免疫治疗是目前最具前景和最值得期待的研究方向。本文重点综述各细胞因子抗体在AR治疗中的作用和相关分子机制，希望能为AR免疫治疗的临床应用提供理论依据。

1 肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体

TNF-α是一种多功能炎症细胞因子，主要由单核-巨噬细胞通过免疫球蛋白(Ig)E依赖的方式产生并释放，可促使Th细胞向Th2方向分化，导致Th1/Th2分泌的细胞因子失衡，诱导由免疫球蛋白(Ig)E介导的Ⅰ型变态反应，是AR治疗研究的靶点之一[1]。唐桥斐等[2]采用腹腔注射及鼻腔滴注卵清蛋白(OVA)的方法成功建立AR小鼠模型。实验组小鼠鼻腔滴入TNF-α单克隆抗体，并对小鼠进行行为学评分。建模成功后处死小鼠，取其鼻腔分泌物及鼻黏膜组织进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化，TUNEL原位末端标记法观察细胞凋亡情况，并采用酶联免疫吸附试验检测鼻黏膜液中TNF-α、白细胞介素(IL)-1β、IgE的表达水平，蛋白质印迹法检测核因子(NF)-κB p65、NF-κB抑制蛋白及凋亡相关蛋白水平变化。结果发现，实验组小鼠的鼻腔黏膜炎性反应明显减轻，组织切片中无明显腺体增生和嗜酸性粒细胞浸润，凋亡细胞数量较对照组明显减少。此外，TNF-α、IL-1β、IgE水平均降低，NF-κB p65、cleaved caspase-3、Bax相对表达水平降低(P<0.01)，NF-κB抑制蛋白与B淋巴细胞瘤-2蛋白相对表达水平升高(P<0.01)。TNF-α抗体能有效减少鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的数量和趋化因子的表达，并抑制NF-κB信号通路的激活，减低特异性变态反应，进而对AR起到治疗作用，这一结论已得到相关研究证实[3]。

自噬是真核生物细胞内程序性死亡的一种特殊方式，在多种生物学过程中发挥重要作用[4]。AR大鼠鼻黏膜上皮细胞中存在线粒体自噬现象[5]，应用自噬抑制剂3-甲基嘌呤可显著改善OVA诱导的哮喘小鼠肺组织的病理学变化，降低肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞数量[6]，说明自噬参与了变态反应炎症的发生和发展，但具体机制尚不明确。张爽等[7]的研究结果显示，AR小鼠鼻黏膜组织中LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1、ATG5及ATG7的表达水平较对照组升高，p62的表达水平降低，进一步证实了细胞自噬参与了AR的发病机制。而采用TNF-α单克隆抗体干预后，上述细胞因子的表达水平明显降低，p62的表达水平明显升高。自噬抑制剂3-甲基嘌呤和激活剂西罗莫司的相反作用，更进一步证实了TNF-α单克隆抗体对AR小鼠的治疗作用可能同降低细胞自噬水平有关。

2 IL-17/IL-6抗体

董庆喆等[8]的研究方法与唐桥斐等[2]相似，通过小鼠腹腔注射及鼻腔滴注OVA建立AR模型成功后，在每次鼻腔激发之前的不同时间给予生理盐水和不同剂量的IL-17 mAb滴鼻和(或)腹腔注射，进而对小鼠进行行为学评分，用迪夫快速染色液法观察鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞浸润情况，酶联免疫吸附试验检测血清及鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10水平，鼻黏膜组织行甲苯胺蓝染色观察肥大细胞数量及脱颗粒情况。研究结果表明，F组小鼠(于每次OVA鼻腔激发前4 h给予5 μg IL-17 mAb腹腔注射)行为学评分(挠鼻及喷嚏次数)，以及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。IL-17A是Th17细胞分泌的主要细胞因子，可诱导IL-6、IL-8等细胞因子的合成和分泌，是一种致炎细胞因子[9]，在变态反应疾病的发生发展中起重要作用。高剂量的(5 μg)IL-17 mAb腹腔注射处于激发阶段的AR小鼠，促使AR小鼠血清中IL-6水平降低，而血清中及鼻腔灌洗液中IL-10水平升高，这些细胞因子的水平变化可能是通过抑制Th17，从而促进Treg的分化，进而对变态反应产生抑制作用。该研究证实了IL-17单克隆抗体对AR具有治疗作用，但并未给出推荐的剂量和给药途径，尚有待进一步研究。

IL-6主要由淋巴细胞及巨噬细胞等多种免疫细胞产生，既是促炎因子又是抑炎因子。它是感染性疾病、关节炎、肿瘤等疾病处于急性期时的一种重要炎症介质。IL-6水平与疾病治疗效果密切相关[10]。刘阳等[11]的研究证实IL-6抗体对AR小鼠有明确的治疗作用：在激发阶段鼻腔给予IL-6抗体后，小鼠鼻腔灌洗液中Th2细胞的标志性细胞因子IL-4水平明显降低，而Th1细胞的标志性细胞因子干扰素-γ没有明显变化，提示IL-6抗体可能通过直接或间接抑制Th2细胞因子分泌，从而抑制变态反应，具体机制尚有待进一步研究。

3 IgE单克隆抗体

奥马珠单克隆抗体是目前最具代表性的IgE单克隆抗体，是通过杂交瘤技术获取的重组人源化IgE单克隆抗体。为了避免发生药敏反应，人为去除了抗原决定区，仅保留与IgE结合的互补决定区，奥马珠单克隆抗体具有高IgE特异性和结合力，但仅与游离IgE结合，以避免受体交联和相关炎症细胞的激活，这是其安全性的重要保证。除了细胞免疫之外，因为奥马珠单克隆抗体能与B淋巴母细胞和记忆B淋巴细胞膜表面的IgE结合，因此对体液免疫也有一定的抑制作用。目前，奥马珠单克隆抗体主要用于12岁以上中、重度变应性哮喘的第五级治疗[12-13]，但其对AR的治疗作用也正日益受到关注。

奥马珠单克隆抗体的治疗效果具有剂量依赖性，给药剂量取决于患者治疗前的体质量和血清IgE水平，当奥马珠单克隆抗体的剂量达到基础IgE水平的15倍以上时，即可迅速降低血清中游离IgE的水平，进而对变应性哮喘和AR起到显著的治疗效果，尤其对中、重度AR治疗效果更佳。但奥马珠单克隆抗体起效缓慢，至少需要28周的时间，对于急性哮喘和鼻炎发作的患者而言，给药周期过长。而且奥马珠单克隆抗体的疗效与血清游离IgE水平密切相关，所以在临床症状缓解后不能骤然停药，否则将引起血清游离IgE水平骤然升高，从而导致哮喘和鼻炎复发并加重，甚至引发生命危险。奥马珠单克隆抗体总体耐受性良好，常见不良反应有头痛、上呼吸道感染、注射部位红肿等，常可自行消退，目前尚未见药物过敏等严重不良反应的报道，临床应用前景广阔[14]。

奥马珠单克隆抗体的安全性在其他研究中也得到证实，LIAO等[15]报道2例接受奥马珠单克隆抗体治疗的妊娠期慢性自发性荨麻疹患者，并回顾分析11例妊娠期接受奥马珠单克隆抗体治疗患者的公开资料。结论是所有患者的慢性自发性荨麻疹得到有效控制，孕期无明显不良反应，并最终产下健康婴儿。

利格列珠单克隆抗体是人源化IgE抗体，与IgE结合的亲和力高于奥马珠单克隆抗体。TRISCHLER等[16]的多中心、随机、双盲研究证实，利格列珠单克隆抗体对轻度过敏性哮喘患者吸入和皮肤过敏源激发反应的疗效大于奥马珠单克隆抗体，但对于大剂量吸入皮质激素联合长效β2-激动剂未得到充分控制的重症哮喘患者，利格列珠单克隆抗体并未显示出优于安慰剂或奥马珠单克隆抗体的优势。

4 趋化因子受体抗体

趋化因子是由成纤维细胞、单核细胞、淋巴细胞、上皮细胞、激活的血小板等分泌的一类小分子分泌型蛋白质，由70～100个氨基酸组成。其主要作用是通过与趋化因子受体结合，趋化各类炎症细胞在局部聚集，从而引发炎性反应，如AR患者的鼻黏膜组织切片中可以见到大量的嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞浸润，且都处于活化状态。与AR的发病关系较密切的趋化因子是CCL和CXCL两类。

Rantes/CCL5是CCL家族中的一种趋化嗜酸粒细胞和T淋巴细胞的趋化因子。Rantes在AR鼻黏膜组织匀浆中的水平明显高于正常鼻黏膜组织，实时荧光定量PCR检测也证实Rantes的mRNA表达明显升高。应用Rantes受体拮抗剂AOP-Rantes可以有效阻止嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞在鼻黏膜的局部聚集，从而减轻鼻炎症状。Eotaxin也是属于CCL家族，由73个氨基酸组成，是一种嗜酸粒细胞特异性趋化因子。HANAZAWA等[17]对9例AR患者采用Eotaxin喷鼻，结果诱发典型的AR症状，鼻腔灌洗液中发现大量嗜酸性粒细胞，而在鼻腔灌洗液和鼻黏膜中淋巴细胞、嗜碱粒细胞和巨噬细胞的数量并无改变,因此推测Eotaxin是嗜酸粒细胞特异性趋化因子，与AR发病有着密切的关系。Eotaxin可以动员骨髓中的嗜酸性粒细胞入血，促进嗜酸性粒细胞与内皮细胞黏附，增加血管通透性，使其得以在局部组织聚集，并活化局部组织的嗜酸性粒细胞，释放炎症因子而引发变态反应。

单核细胞趋化蛋白(MCPs1-5)也是一种CCL类趋化因子，其中与AR有关的亚型主要是MCP-1、MCP-3、MCP-4。组胺能诱导AR患者鼻黏膜中CCL类趋化因子(包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、Rantes)的表达，而这些趋化因子又促进炎症细胞在局部聚集，进一步释放组胺等炎症递质，如此形成恶性循环，导致AR加重和反复发作。

所有的趋化因子都是通过与其相应的趋化因子受体结合而发挥作用。具有抗原提呈作用的树突状细胞表面表达CCR7，通过与CCL21结合，促使树突状细胞从淋巴结游走并聚集到炎症局部，Th0细胞接触到树突状细胞提呈的变应原后，分化为Th2细胞，导致Th2与Th1细胞失衡。Th2细胞表面主要表达CCR4和CCR8，而Th1细胞表面主要表达CXCR3和CCR5。Th2细胞通过产生IL-4和IL-13，诱导B淋巴细胞分化产生抗原特异性IgE，IgE及其特异性高亲和力受体FcεRI在肥大细胞、嗜酸性粒细胞表面结合，完成过敏反应的致敏阶段，当机体再次接触过敏源时，过敏源直接与致敏细胞膜上的受体FcεRI结合，产生IgE交联，激活下游信号通路，诱发瀑布式级联变态反应，使机体出现严重的过敏症状[18]。

嗜酸粒细胞是呼吸道过敏性疾病中的主要效应细胞，其表面主要表达CCR3和CCR1，以CCR3为主。CCR3能与多种CCL类趋化因子结合，包括Rantes、Eotaxin、MCP-1、MCP-3等，是介导嗜酸粒细胞到达炎症局部的主要趋化因子受体，在AR的发病机制中起重要作用。有研究证实，抗原激发后嗜酸性粒细胞、CD34+、CD34+/CCR3+在哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液、外周血骨髓悬液中有不同程度的升高[18]。模型组小鼠的肺泡灌洗液中Eotaxin水平在抗原激发后6 h与对照组相比有明显升高[19]。抗-CCR3单克隆抗体可能成为AR免疫治疗中重要的研究方向。

CCR3主要位于细胞质中的内质网等细胞内膜系统中[20]。CCR3可以与CCL11、CCL24、CCL26等多种趋化因子结合，其中对CCL11亲和力最大[21]。CCR3由胞外N-末端、7个跨膜α螺旋(TM核心)、胞内C-末端、3个胞内环和胞外环组成。趋化因子与胞外N-末端及胞外环结合后，诱导CCR3发生变构和磷酸化，激活PI3K信号通路，从而激发ERK1/2，PI3Kγ等多种下游信号通路发生作用[22]。CCR3主要通过与自分泌的Eotaxin结合，诱发嗜酸性粒细胞原位造血，即诱导CD34+、CD38+等多种骨髓干细胞向嗜酸性粒细胞分化并向炎症部位聚集，进而通过胞吐作用、零碎脱颗粒、细胞溶解等多种方式进行脱颗粒，释放嗜酸粒细胞阳离子蛋白、嗜酸粒细胞过氧化物酶、嗜酸粒细胞源神经毒素、主要碱性蛋白等多种炎症介质[23-25]，破坏细胞膜磷脂双分子层的完整性，从而损伤气道上皮，导致气道高反应，还可以通过合成白三烯诱发剧烈的气道收缩，最终导致变态反应性病理改变和临床症状[26]。

肥大细胞也是变态反应的主要效应细胞之一，由骨髓中表达CD34+、CD117+和CD13+的多能祖细胞分化而成。根据肥大细胞分泌颗粒的特异性及蛋白酶差异，将人类肥大细胞分为MCT和MCTC两种亚型，后者主要存在于皮肤及黏膜下层。在接触过敏源后，肥大细胞升高Eotaxin-1的表达，其N-末端丝氨酸残基可与CCR3特异性定向结合，CCR3通过激活G蛋白释放FcεRIa亚基，然后将其耦合到磷脂酰肌醇3-激酶γ并扩增变应原刺激的Ca2+内流，刺激肥大细胞脱颗粒。FcεRI的四聚体与IgE结合的高亲和力及缓慢解离的特点，决定其在速发相过敏反应中的关键作用，也是肥大细胞持续致敏和对过敏源易感的基础[27]。CCR3抗体能有效阻断上述信号传导通路，在各种变态反应性疾病中起到治疗作用。CCR3基因敲除或应用CCR3抑制剂AXP1275均可明显抑制AR小鼠鼻黏膜内嗜酸性粒细胞脱颗粒过程、IgE表达等[28]。