超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量

2021-03-25董方张群峰阮建云

江苏农业学报 2021年1期

董方　张群峰　阮建云

摘要：基于超高效液相色譜-三重四级杆串联质谱（UPLC-QqQ-MS/MS）联用技术对茶叶中黄酮醇糖苷（FGs）种类及含量进行测定并对提取方式和检测条件进行优化。用75%（体积分数）甲醇水溶液提取目标化合物，再用Waters Acquity HSS T3色谱柱（粒径为1.8 μm，长度×内径为100.0 mm×2.1 mm）分离目标化合物，以含有0.1%（体积分数）甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子源（ESI+）与质谱多反应监测（MRM）方法对成品茶中15种FGs进行定量测定。结果表明，在0.1～20.0 μg/ml的质量浓度范围内FGs的基质标准曲线的线性关系良好，其检测限（LOD）为0.08～0.23 μg/L，定量限（LOQ）为0.25～0.76 μg/L，相对标准偏差（RSD）为1.30%～2.80%，出峰时间为3.60～7.40 min。与现有最优检测技术相比，超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法具有分析速度快、灵敏度高、稳定性好等特点，可为提高茶叶品质成分的检测效率提供参考。

关键词：茶叶;黄酮醇糖苷;超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法;质谱多反应监测;优化

中图分类号： O658;TS272 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）01-0204-09

Determination of flavonol glycosides in teas by ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry

DONG Fang1，2， ZHANG Qun-feng2， RUAN Jian-yun 2

（1.Institute of Horticulture， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang 330200， China;2.Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China）

Abstract： The extraction methods and detection conditions of flavonol glycosides （FGs） in teas were optimized based on ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry （UPLC-QqQ-MS/MS） technology， and the varieties and contents were determined. The target compounds were extracted with 75% （volume fraction） methanol aqueous solution， separated on Waters Acquity HSS T3 column （particle size was 1.8 μm， length × inner diameter was 100.0 mm × 2.1 mm）， and gradient elution was carried out using acetonitrile solution containing 0.1% （volume fraction） formic acid as moving phase. Positive electrospray ionization （ESI+） and mass spectrometry multiple reaction monitoring （MRM） methods were used to quantitatively determine 15 flavonol glycosides in made teas. The results indicated that the matrix standard curve of FGs showed a good linearity in the concentration range of 0.1-20.0 μg/ml， the limit of detection （LOD） was 0.08-0.23 μg/L， the limit of quantity （LOQ） was 0.25-0.76 μg/L， the relative standard deviation （RSD） was 1.30%-2.80%， and the peak out time was 3.60-7.40 min. Compared with the existing optimal detection technology， UPLC-QqQ-MS/MS method has fast analysis speed， high sensitivity and good stability， which can provide reference for improving the detection efficiency of tea quality components.

Key words： tea;flavonol glycosides;ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry;mass spectrometry multiple reaction monitoring;optimization

黄酮醇糖苷（Flavonols glycosides，FGs）是茶叶中除儿茶素外较为重要的多酚类物质之一，大都由黄酮醇苷元（杨梅素、槲皮素、山柰酚等）或黄酮苷元（芹菜素等）与糖分子（葡萄糖、半乳糖、芸香糖等）结合形成O-糖苷[1-2]。已有研究发现，FGs不仅对茶叶中的苦涩味及茶汤的光泽度、亮度具有重要作用[3-6]，而且具有类黄酮物质的生理学共性，在生物体中发挥着抗氧化、清除活性氧自由基及抵御紫外线、抗菌抑菌等作用[7-8]。

国内外有很多FGs检测方法的报道，目前常用的检测方法主要包括紫外分光光度法（UV spectrophotometer）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱检测法（LC-MS）、超高效液相色谱法（UPLC）、毛细管电泳法（CE）及电化学检测法（ED）等[9]。超高效液相色谱是一种基于HPLC系统开发的色谱技术，它充分利用了小粒度色谱柱、超高压液相色谱泵的优势，能够更灵敏、更快速地实现分离检测，目前已在茶（Camellia sinensis L.）、洋葱（Allium cepa L.）和银杏（Ginkgo biloba L.）等多种植物的FGs检测中得到应用[10-12]。Kim等[13]采用UPLC-PDA（超高效液相色谱-二极管阵列）建立了针对荞麦、红茶、野生欧芹FGs类化合物的检测方法，共有12种FGs得到了较好的分离，但是其含量的线性范围较大，为0.88～14.00 mg/kg;Jiang等[14]首次采用UPLC检测到绿茶、乌龙茶和红茶中18种FGs类化合物，但是分离时间较长，为30～60 min;刘阳等[2]研究了FGs在绿茶中的浸出特性，并基于常规HPLC检测方法，分离并定量了11种与茶汤滋味相关性最高的黄酮苷类物质，但也存在分离时间长、定量准确度低的问题。UPLC与MS/MS的联用，已经成为植物化学组分研究的新趋势，为茶叶中化合物的痕量分析提供了定量保证。本研究基于多种FGs标准品，在已有研究结果的基础上，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法（UPLC-QqQ-MS/MS），并结合紫外光谱、质谱参数和色谱保留规律，测定茶叶中FGs种类和含量，以期实现快速分离和准确鉴定茶叶中的FGs。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶成品茶（西湖龙井）产自浙江省杭州市西湖区中国农业科学院茶叶研究所示范园（120°5′21.39″E，30°10′57.19″N），原料品种为龙井43，选用清明前1芽1叶，由杭州龙冠实业公司提供;红茶成品茶（滇红金针）产自云南省农业科学院茶叶研究所科研试验基地（100°25′55.19″E，21°59′25.76″N），原料品种为云南勐海大叶种，选用清明前1芽1叶，由勐海县云茶科技有限公司提供。

甲醇（质谱级）、乙腈（质谱级），产自德国Merck公司;甲酸（色谱级）、杨梅素-3-半乳糖苷（M-3-Ga）标准品、杨梅素-3-葡萄糖苷（M-3-G）标准品、槲皮素-3-半乳糖苷（Q-3-Ga）标准品、槲皮素-3-葡萄糖苷（Q-3-G）标准品、槲皮素-3-半乳糖-鼠李糖苷（Q-3-GaRh）标准品、槲皮素-3-葡萄糖-鼠李糖苷（Q-3-GRh）标准品、山柰酚-3-半乳糖苷（K-3-Ga）标准品、山柰酚-3-葡萄糖苷（K-3-G）标准品、山柰酚-3-半乳糖-鼠李糖苷（K-3-GaRh）标准品、山柰酚-3-葡萄糖-鼠李糖苷（K-3-GRh）标准品，所有标准样品纯度≥98%，均产自美国Sigma公司;试验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

艾卡A11基本型分析研磨机，产自德国IKA公司;BT125D型电子分析天平，产自德国Sartorius公司;Thermo Heraeus Fresco 17微量冷冻离心机，产自美国赛默飞世尔科技公司;KQ-500E型超声波清洗机，产自昆山超声波仪器公司;超高效液相色谱-三重四极杆-串联质谱联用仪（ACQUITY UPLC-QqQ-MS/MS H-Class），配有ACQUITY UPLC二极管阵列（PDA）检测器、Acquity HSS T3色谱柱（粒径为1.8 μm，柱长×内径为 100.0 mm×2.1 mm），产自美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备准确称取M-3-Ga标准品、M-3-G标准品、Q-3-Ga标准品、Q-3-G标准品、Q-3-GaRh标准品、Q-3-GRh标准品、K-3-Ga标准品、K-3-G标准品、K-3-GaRh标准品、K-3-GRh标准品，分别加入75%（体积分数）甲醇溶液振荡超声处理（振荡频率为3 000 r/min，超声功率为40 kHz，超声时间为10 min），配制成质量浓度为1.0 mg/ml的母液。用75%（体积分数）甲醇溶液稀释上述标准品的母液，配制成质量浓度分别为0.1 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml的标准工作溶液。

1.3.2 供试样品的前处理供试样品的前处理方法参照Zhang等[15-16]的方法。取适量成品绿茶、成品红茶，用研磨机磨碎后精确称取50 mg磨碎的成品绿茶、成品红茶样品，分别溶解于1 ml 75%（体积分数）甲醇溶液中，用最大频率（40 kHz）连续超声处理10 min，之后再于12 000 r/min离心10 min，取500 μl上清液，加入500 μl 75%（体积分数）甲醇溶液稀释，然后过0.22 μm聚四氯乙烯（PTFE）滤膜，用于上机分析，每种茶设3个重复。

1.3.3 仪器分析条件色谱条件：采用Waters Acquity HSS T3色谱柱（粒径为1.8 μm，柱长×内径为100.0 mm×2.1 mm，产自Waters公司，产地为美国Milford）进行分离。洗脱条件参照Zhang等[15，17]的方法，流动相A为0.1%（体积分数）甲酸，流动相B为乙腈（混有体积分数为0.1%的甲酸），洗脱程序：0 min，5%乙腈;0.1～3.0 min，5%～20%乙腈;3.1～4.3 min，20%乙腈;4.4～9.0 min，20%～45%乙腈;9.1～11.0 min，45%～100%乙腈;11.1～13.0 min，100%乙腈;13.1～15.0 min，回到5%乙腈的初始條件。所有试验的柱温均设置为40 ℃，样品温度设置为6 ℃，流速为0.4 ml/min，进样量为2 μl，紫外（UV）检测波长为370 nm。

质谱条件：采用Waters Xevo TQ质谱仪（Waters公司，产地为Milford， MA， USA），使用电喷雾电离源（ESI）正离子模式，毛细管电压设为3.5 kV，源温度设为150 ℃，脱溶剂温度设为500 ℃，锥孔气体流速设为50 L/h，脱溶剂气体流速设为800 L/h。

1.4 数据处理

采用Mass Lynx 4.0软件对MS检测[含多反应监测（MRM）]与紫外检测器（PDA）检测获得的原始图谱进行质谱峰或紫外光谱峰的提取和积分。标准曲线的绘制、FGs含量的换算采用Excel 2010。

2 结果与分析

2.1 茶叶中黄酮醇糖苷的定性检测

本研究在相同色谱条件、相同质谱条件下对不同茶叶中的黄酮醇糖苷（FGs）进行UPLC分析和MRM分析，结果表明，不同组分的FGs化合物在3.60～7.40 min全部洗脱分离，对应的UPLC色谱图见图1，根据最大波长吸光度，利用FGs标准品，结合二级质谱碎片，并与参考文献[10]、[14]、[17]、[18]比对，鉴定出茶叶中15种FGs，相关定性参数见表1。

由图1还可以看出，杨梅素-3-葡萄糖-鼠李糖苷（M-3-GRh）、槲皮素-3-半乳糖-鼠李糖-葡萄糖苷（Q-3-GaRhG）、槲皮素-3-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷（Q-3-GRhG）、山柰酚-3-半乳糖-鼠李糖-葡萄糖苷（K-3-GaRhG）和山柰酚-3-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷（K-3-GRhG）分别对应1号峰、4号峰、5号峰、10号峰和11号峰，根据它们的相对分子质量、色谱保留的一般规律、二级质谱碎片和相关报道[10，14，17-18]进行综合鉴定;其余FGs根据标准品进行验证，M-3-Ga、M-3-G、Q-3-GaRh、Q-3-GRh、Q-3-Ga、Q-3-G、K-3-GaRh、K-3-GRh、K-3-Ga和K-3-G分别对应2、3、6、7、8、9、12、13、14和15号峰。根据色谱保留的一般规律，在反相色谱柱洗脱的过程中，按出峰时间排序依次为杨梅素糖苷（3个羟基）、槲皮素糖苷（2个羟基）、山柰酚糖苷（1个羟基），10号峰对应的K-3-GaRhG不符合这一规律;对于相同苷元，按出峰时间排序依次为三糖糖苷、二糖糖苷、单糖糖苷，而对于不同苷元的FGs，出峰顺序为半乳糖苷类化合物、葡萄糖苷类化合物。由二级质谱碎片信息可知，杨梅素糖苷、槲皮素糖苷和山柰酚糖苷的主要碎片离子质荷比分别为319、303和287。

2.2 黄酮醇糖苷标准品的质谱分析和色谱分析

为了优化FGs的定量方法，选取Q-3-GRh、M-3-Ga、Q-3-G、K-3-G、K-3-GaRh标准品，采用多反应监测（MRM）和紫外检测器（PDA）检测方法分别建立FGs标准品峰面积与对应质量浓度梯度的标准曲线，综合比较2种检测方法的灵敏性和稳定性。

由表2可以看出，在2种检测方法下，5种FGs标准品的峰面积与对应质量浓度梯度的标准曲线在0.1～20.0 μg/ml质量浓度范围内均具有较好的线性关系（R2>0.99）。从检测限和定量限来看，利用MRM方法的检测限（LOD）为0.08～0.23 μg/L，定量限（LOQ）为0.25～0.76 μg/L;而PDA方法，LOD为1.00～1.58 μg/L，LOQ为3.33～5.25 μg/L，整体上高于前者1～2个数量级。由此可见，MRM方法的检测灵敏度更高。

将提取的同一茶叶样品在2种检测方法下各重复检测6次，结果发现，色谱峰的保留时间波动均小于0.1 min，并且标准品峰面积的相对标准偏差（RSD）约为0.5%，说明MRM方法与PDA方法检测的精密度良好。

准确称取6份质量为50 mg的绿茶样品，按照方法1.3.2进行样品前处理，然后每份样品均采用MRM和PDA 2种方法检测。如表3所示，MRM方法的5种FGs的RSD为1.30%～2.80%，PDA方法的5种FGs的RSD为2.70%～4.70%，说明MRM方法的重复性较PDA方法好。

2.3 茶叶中黄酮醇糖苷的定量检测

由于质谱具有高灵敏度、方法稳定等特点，加上茶叶中的FGs具有良好的色谱分离性能，因此本研究根据现有标准品，选择MRM模式，利用二级质谱准确定量绿茶、红茶中的FGs，优化后的FGs质谱参数见表4，其中母离子均采用加氢离子峰[M+H]+，子离子则为黄酮醇苷元离子。

针对未购置标准品的FGs进行相对定量，具体参照王智聪等[10]的公式进行计算。选取决定系数较高的标准曲线（以M-3-Ga为标准品），用外标法准确定量成茶中的M-3-Ga含量，成茶中其他FGs的含量则根据M-3-Ga质谱峰面积及含量确定。由于无法准确得到无标准品FGs的质谱响应差异，因此假定FGs与M-3-Ga质谱响应一致，具体公式如下：

Cj=AjMjCiDV/mAiMi

式中：Cj、Ci分别表示成茶茶汤中待测FGs含量、M-3-Ga含量;Aj、Ai分别表示待定量FGs化合物的峰面积、M-3-Ga的峰面积;Mj、Mi分别表示待定量FGs化合物的相对分子质量、M-3-Ga的相对分子质量;D表示进样前稀释倍数;V表示提取液体积;m表示样品质量。

如表5所示，不同FGs组分含量在绿茶和红茶间存在一定差异。绿茶中总黄酮醇糖苷含量为5 492.40 mg/kg，而红茶中总黄酮醇糖苷含量为5 910.19 mg/kg，高于绿茶中总黄酮醇糖苷含量。在绿茶中，K-3-GRhG、Q-3-GRhG的含量较高，分别为1 078.03 mg/kg、881.08 mg/kg，而含量较低的是Q-3-GaRh、K-3-GaRh、K-3-G，分别为14.69 mg/kg、14.80 mg/kg、35.19 mg/kg;在红茶中，K-3-GRhG含量最高，达2 027.34 mg/kg，而Q-3-GaRh、K-3-GaRh、K-3-G的含量较低，分别为47.91 mg/kg、42.92 mg/kg、22.59 mg/kg。从不同苷元类型的黄酮醇糖苷含量来看，绿茶中杨梅素糖苷（M-3-GRh、M-3-Ga、M-3-G）总含量为940.18 mg/kg，显著高于红茶中杨梅素糖苷总含量（673.64 mg/kg）;槲皮素糖苷（Q-3-GaRhG、Q-3-GRhG、Q-3-GaRh、Q-3-GRh、Q-3-Ga、Q-3-G）總含量在绿茶中最高，为2 434.29 mg/kg，显著高于红茶中槲皮素糖苷总含量（2 061.34 mg/kg）;而山柰酚糖苷（K-3-GaRhG、K-3-GRhG、K-3-GaRh、K-3-GRh、K-3-Ga、K-3-G）总含量在红茶中占绝对优势，为3 175.21 mg/kg，显著高于绿茶中的山柰酚糖苷总含量（2 117.93 mg/kg）。

本研究利用质谱MRM检测法，基于10种标准品对茶叶FGs检测的质谱条件进行了优化，在成品茶（绿茶、红茶）中鉴定出15种FGs，包括3种杨梅素糖苷、6种槲皮素糖苷和6种山柰酚糖苷。此外，本研究对已有标准品的FGs进行了绝对定量，其余5种基于王智聪等[10]的方法进行相对定量分析。与现有主流方法[3， 10]（表6）相比，优化后的质谱条件使FGs化合物的检测时间缩短了30%，并且组分的分离度更强。Wu等[3]利用负离子检测模式比较了UPLC-QqQ-MS/MS与HPLC-MS的差异，结果表明，UPLC-QqQ-MS/MS法的檢测灵敏度高于HPLC-MS法。而本研究采用正离子模式，进一步证实了在相同仪器设备条件下由二级质谱（MRM检测方法）建立的FGs检测方法的检出限整体上低于PDA方法1～2个数量级，灵敏度更高。与Wu等[3]的方法相比，用正离子模式MRM方法检测的FGs质谱峰响应强度更高，能够有效降低样品机制效应（即干扰组分对目标组分电离的影响）对分析的干扰程度，有利于低质量浓度FGs的定量分析。

3 讨论

3.1 MRM检测方法的优势

本研究选取5种黄酮醇糖苷标准品（Q-3-GRh、M-3-Ga、Q-3-G、K-3-G、K-3-GaRh），分别同时采用MRM检测方法和PDA检测方法，基于方法的灵敏度和稳定性指标分析比较了二者对于茶叶中FGs的定性、定量效果。结果显示，在MRM方法下，成茶中15种FGs被定量测定，并且FGs的基质标准曲线在0.1～20.0 μg/ml质量浓度范围内线性关系良好，其定量限为0.25～0.76 μg/L，检测限为0.08～0.23 μg/L，以上参数均优于PDA检测方法。同时，本研究利用目标化合物的二级质谱碎片进行定量，可以选择性地检测被定量化合物，使同分异构体（如M-3-Ga/M-3-G、Q-3-GaRh/Q-3-GRh）得到较好分离。此外，根据精密度试验和重复性试验的相对标准偏差，MRM检测方法的稳定性优于PDA检测方法。由此可见，基于二级质谱MRM模式建立的茶叶中FGs的MRM检测方法灵敏度和分离度高、稳定性好。然而，当不需要较高的灵敏度和特异的分离度时，PDA检测方法可以作为MRM检测的1种快速且经济的替代方法，茶叶中主要FGs化合物的色谱峰根据其保留时间能够轻松地得到鉴定，并通过积分进行定量分析[21]。

3.2 MS（MRM）检测条件的优化

样品前处理对于样品鉴定和结果的准确性有至关重要的影响[22]。溶剂法是黄酮类化合物常用的提取方法，利用热水法和有机溶剂法均能提取黄酮醇苷类物质。陈丛瑾等[23]研究发现，黄酮苷类物质易溶于水以及甲醇、乙醇等强极性溶剂，高浓度的醇易于提取苷元，而用60%（体积分数）乙醇或甲醇能有效提取含苷类的黄酮类化合物。尽管沸水也能够提高黄酮苷类物质提取率，但易将蛋白质、糖类等化合物溶于水中，从而降低了黄酮醇苷的浸出率。因此，本研究以75%（体积分数）甲醇作为提取剂，结果显示，色谱峰分离效果优于其他试验结果[2-3，13，20-21]。超高效液相色谱（UPLC）的出峰时间通常由物质本身的性质、固定相（色谱柱填料、柱长短、粒径）、流动相、柱温和流速等因素共同决定。本研究采用T3色谱柱，与Kim等[13-14]采用的C18色谱柱相比，T3色谱柱对极性较强的FGs类化合物的保留效果好。Kim等[13]选用含有1.0%（体积分数）甲酸的15%（体积分数）乙腈作为流动相进行等度洗脱，本研究使用含有0.1%（体积分数）甲酸的99.9%（体积分数）乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，并且在分离时间、峰型方面的优势明显，能够保证短时间内将样品中的强保留组分洗脱。此外，在本研究中柱温设为40 ℃，流速设为0.4 ml/min，相较于Kim等[13-14]的方法，在温度、流速上均提高了50%，由此说明，在相同仪器条件下，适当提高柱温、流速有利于缩短FGs的分离时间，提高分离度。

3.3 黄酮醇糖苷在成茶中的积累与分布

不同茶树品种、产地的生长环境和加工工艺造成了茶叶品质成分的差异。有研究发现，UV-B辐射的增强、温度的升高均能够提升植物体的FGs含量[24-25]。本研究发现，与浙江茶区相比，云南茶区纬度低、海拔高，紫外线强度相对较高，加上较高的环境温度会诱导茶树体内的碳代谢，从而促进多酚类物质（FGs、儿茶素等）的积累;相反，在浙江茶区，纬度高，海拔低，春季温度相对较低，有利于加速茶树体内的氮代谢，促进茶树体内氨基酸的合成，而茶树类黄酮物质的合成相对受到抑制[26-27]。FGs对于茶汤的苦味、涩味具有增强作用，一般认为酚氨比值低的茶鲜爽味高，适制绿茶，而酚氨比值高的茶苦味和涩味较高，适合加工成红茶[18]。由此可见，云南茶区的茶叶更有利于加工成红茶、黑茶等发酵茶，而浙江茶区的环境条件为绿茶的加工提供了品质保证。

从品种的适制性来看，不同叶型茶树品种的适制性也有差异。研究发现，与小叶种茶树相比，大叶种茶树的多酚类物质含量高10%以上，因此更适合加工成红茶，而小叶种茶树的氨基酸含量高，适合制成绿茶[28]。戴伟东等[18]对FGs与茶树品种适制性的研究发现，黄酮醇半乳糖苷化代谢旺盛的茶树品种适制绿茶，而黄酮醇葡萄糖苷化代谢旺盛的茶树品种适制红茶。FGs组分中的K-3-G/K-3-Ga组分被认为与茶汤涩味高度相关，其含量的积累变化规律对茶叶的适制性起到了指示作用。而在本研究中，成品红茶中的K-3-G含量及其葡萄糖苷化程度（K-3-G与K-3-Ga的比值）均小于绿茶成品茶，推测茶叶在发酵过程中可能降低了K-3-G含量，从而使红茶的涩味降低。

陈宗懋等[29]的统计结果显示，红茶中的总FGs含量要高于绿茶，这与本研究结果一致。但Peterson等[30]的研究结果与之相反，即在绿茶、乌龙茶中，总FGs含量则高于红茶。Jiang等[14]通过UPLC方法，在3类成品茶中共检测到18种FGs，发现绿茶中的山柰酚糖苷组分含量最高，而红茶中的槲皮素糖苷含量占绝对优势。本研究结果则与之相反，即在绿茶中以槲皮素糖苷为主，而在红茶中则以山柰酚糖苷为主。由此可见，茶叶中的FGs含量可能受多种因素影响而呈动态变化，对不同茶类FGs的积累与分布规律仍需深入研究。

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（责任编辑：徐艳）

收稿日期：2020-05-14

基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0200900）;国家茶产业技术体系建设专项（CARS-19）