周珮珮 ，周 霖＃，师莹莹，张 俊，左莉华，刘丽伟，李卓伦，张梦雅，李 嘉，孙 志，杜书章*

(1.郑州大学第一附属医院药学部，河南 郑州 450052；2.河南省精准临床药学重点实验室，河南 郑州 450052）

慢性盆腔炎是一种易发于女性生殖器官内和周围结缔组织及盆腔腹膜的慢性妇科疾病,患者主要表现为下腹部坠痛、月经不调、痛经、白带增多及腰骶部胀痛等［1-3］。该疾病具有病程较长、病情顽固、易复发发作、迁延难愈等显著特点,严重影响患者的身心健康［4］。目前,临床上主要依靠抗生素类药物对慢性盆腔炎进行治疗,然而,患者在长时间使用这类药物后,常易出现肝肾功能损伤、菌群失调以及耐药等多种不良事件［5-6］。

中医药作为中华民族传统文化的瑰宝,在治疗各类疾病方面积累了丰富的经验,并以其“高效低毒” 的显著特点,目前广泛应用于临床治疗过程中。中医辨证认为慢性盆腔炎主要是由气滞血瘀、寒凝气滞、脾虚瘀浊等诸因导致,因此,具有行气、活血、化瘀作用的药物将对该疾病具有很好的标本兼治功效［4］。妇可靖胶囊是由丹参、红花、赤芍、当归等二十多种药材配伍而成的中药复方制剂,该药中北败酱、蒲公英、车前子清热利湿,解毒排脓为君药,川芎、赤芍、三七、红花、丹参活血化瘀；延胡索疏肝理气,止疼痛为臣药；白术、茯苓益气健脾,补气生血,鳖甲、地骨皮滋补阴液,凉血除蒸,当归、熟地黄养血调经,白芍滋阴柔肝,共为佐药。马齿苋、柴胡为臣药。诸药合用,共奏清热利湿,化瘀散结,行气止痛,调补气血之功,对于淤毒内结、气滞血瘀所致的慢性盆腔炎具有很好的针对性治疗作用。同时,中药及其复方制剂具有多成分、多靶点、多途径等协同作用效果,使得依靠传统的“单成分、单靶点” 研究思路已经很难对其进行较为整体、系统的作用机制研究［7-8］。随着各种组学理论、高通量筛选、分析技术的发展以及计算方法的不断进步,网络药理学以其系统生物学、多向药理学为理论基础的研究策略与传统中医症候的理念具有异曲同工之妙,体现了生物平衡的理念,特别适用于中药的复杂作用机制研究［9］。

课题组拟借助网络药理学的研究思路,从系统生物整体的角度去深入探讨妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的潜在活性成分及作用机制,为进一步的药效物质基础和作用机制以及靶向新药研发提供重要的参考依据。

1 资料与方法

1.1 主要网络数据库及软件 TCMSP 数据库(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Therapeutic Target Database数据库(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、OMIM 数据库 (http://www.omim.org/)、DAVID (http://bioinfo.Capitalbio.com/mas3/)、Cytoscape 3.6.1 软件。

1.2 活性成分及靶点筛选 通过检索中药药理学分析平台(TCMSP),并以妇可靖胶囊的20 余味药材组成“北败酱、车前子、蒲公英、香附(醋制)、赤芍、红花、丹参、延胡索、三七、秦艽、地骨皮、鳖甲、海藻、党参、白术(炒)、茯苓、熟地、当归、马齿苋、柴胡” 等为关键词检索其药物活性成分及相关靶点。中药活性成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB) 主要反映其化合物的吸收程度；类药性(Drug Likeness,DL) 是化合物与已知药物的类似性,OB 和DL 值是中药能够吸收入血并分布至靶器官发挥药效作用的两大关键指标。本研究首先采用TCMSP 数据库查询每个药物活性成分的OB 和DL 值,设定其化学成分须同时满足OB≥35% 且DL≥0.25,初步筛选出候选成分,通过活性成分-靶点网络degree 值进一步筛选活性成分。

1.3 活性成分-靶点网络构建 由于药物成分对应的靶点可能存在命名不规范或不统一的问题,因而首先通过UniProt 数据库(http://www.uniprot.org/uploadlists/) 转换候选成分对应的靶点基因名,再将化合物及对应的靶基因数据导入Cytoscape 3.6.1 软件,构建妇可靖胶囊的活性成分-靶点网络图。其中,度值(degree) 反映所构建网络中某一节点与其它节点的总连接数目；介数是指网络中所有最短路径中经过某节点的路径数目与最短路径总数的比值,度值和介数是体现某节点在网络中重要性的关键拓扑参数。

1.4 慢性盆腔炎相关疾病靶点筛选 本研究通过药物靶标数据库(Therapeutic Target Database,TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp) 和孟德尔遗传数据库 (Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org/) 数据库检索慢性盆腔炎相关靶点,然后将筛选得到的药物靶点信息和慢性盘腔炎疾病靶点信息进行对比分析。

1.5 妇可靖治疗慢性盆腔炎的关键靶点筛选 根据筛选得到的药物成分靶点和疾病靶点信息,采用Cystoscope 3.6.1软件构建蛋白互作网络(protein protein interaction,PPI),取其交集,运用Network Analysis 对网络进行拓扑结构分析。在分析得到的拓扑网络结构信息中,选择连接度(degree) 大于2 倍以上中位数值的节点作为关键候选靶点并生成网络。再分析该网络并得到新的拓扑网络信息,计算每个节点的“连接度” “接近中心性(Closeness Centrality,CC) ” “中介中心度(Betweenness Centrality,BC) ” “邻域连通性(Neighborhood Connectivity,NC) ” 4 个拓扑结构特征值并进行二次筛选,最终选择以上四者特征值均大于其相应中位数的节点作为其关键靶点。

1.6 KEGG 信号通路及GO 生物过程富集分析 将得到的妇可靖治疗慢性盆腔炎的关键潜在靶点在人类基因组注释数据库DAVID 6.8 (http://david.ncifcrf.gov/) 进行KEGG 通路注释分析和GO 富集分析,以P＜0.05 为标准进行筛选。由此,关键靶点(基因) 可直接映射到通路上,这些富集得到的通路即是药物发挥治疗疾病并起调节作用的关键途径,通过该方法可得到妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的代谢通路及相关生物学过程等相关信息。

1.7 妇可靖胶囊“活性成分-靶点-通路” 网络模型图构建 将妇可靖胶囊中的活性成分、对应预测靶点和通路分析结果,分别构建“活性成分-靶点”、“靶点-通路” 之间的相互关系,将其导入Cytoscape 软件中构建妇可靖胶囊相关“活性成分-靶点-通路” 网络模型图。

2 结果

2.1 主要活性成分信息与活性成分-靶点网络 本研究经设定的OB 及DL 进行筛选后,共得到91 个具有良好的口服吸收利用度和类药性的药物活性成分,见表1。通过TCMSP 数据库预测91 个药物成分作用靶点,在TCMSP 数据库里根据OB 和DL 值筛选并采用uniprot 数据库改正药物名称为其规范名称,删除没有规范名称与重复后共得到154个潜在靶点,同时构建妇可靖胶囊的主要活性成分-靶点网络图,如图1 所示。分析网络图可知,其中21 个成分作用靶点频率大于33,通过频率发现,妇可靖的活性成分与PTGS、MAPK、NOS 等炎症靶点群相关,如表2 所示。

表1 基于TCMSP 筛选的妇可靖胶囊潜在活性成分

续表1

表2 妇可靖胶囊91 种成分的潜在作用靶点（频数≥33 次）

2.2 妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的关键靶点筛选 本研究基于多个数据库及挖掘文献数据,共搜到慢性盆腔炎相关靶点203 个。将203 个疾病相关靶点与在TCMSP 数据库中得到的成分靶点进行比对分析,共得到28 个妇可靖治疗慢性盆腔炎的潜在作用靶点,见表3。

表3 妇可靖胶囊治疗盆腔炎的潜在作用靶点

图1 妇可靖胶囊主要活性成分-靶点网络图

为了进一步揭示治疗盆腔炎炎症作用靶点的潜在机制,采用Cytoscape 3.6.1 软件构建有效活性成分靶点的PPI 及疾病靶点的PPI,结果发现共有5 260 个成分预测靶点及7 496个慢性盆腔炎疾病靶点具有蛋白-蛋白相互作用(其中包括4 118 个重叠靶点),表明78.29% 的成分靶点和54.94%的疾病靶点具有直接或间接的相互作用。取药物成分及疾病靶点的蛋白质互作网络交集靶点,然后分析每个点的拓扑结构特征值,得出其“连接度” 中位数值为33,因此,第一次选择“degree≥66” 的节点作为候选靶点(2倍以上中位数),共得到1 025 个靶点。接着对候选靶点的信息再次进行提取分析,并以“连接度” “接近中心性”“中介中心度” “邻域连通性” 大于其相应中位数为第二次筛选条件进一步选择合适的节点,即degree≥72,CC≥0.51,BC≥3.7×10-4,NC≥124.46,最终得到妇可靖治疗慢性盆腔炎的关键靶点797 个,见图2。

图2 妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的关键靶点筛选

2.3 核心靶点的KEGG 信号通路及GO 生物过程富集分析

2.3.1 KEGG 通路富集分析 将筛选到的核心靶蛋白导入DAVID 数据库进行KEGG 富集分析,条件设置为P＜0.05且FDR＜0.05 (错误发现率),剔除不相关通路后,共得到重要通路8 条,分别为肿瘤坏死因子信号通路、NOD 样受体信号通路、Toll 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、NF-κ B 信号通路、白细胞经内皮迁移及MAPK 信号通路等,结果见表4。由此可知,与妇可靖治疗慢性盆腔炎相关性最大的通路是MAPK 信号通路,将相关靶点经过通路富集分析后,映射在该通路上的靶点数最多,P值显著。TNF 信号通路与慢性盆腔炎的发生关系密切,从代谢通路结果显示可推断妇可靖胶囊可能主要通过干预NOD 样受体主介导下游MAPK 与NF-κB 蛋白靶点激活TNF 通路,调节TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子,并降低其表达水平,抑制子宫内膜炎症细胞增生,起到治疗炎症疾病的作用。

表4 经KEGG 富集分析后的主要通路

2.3.2 GO 生物过程富集分析 将筛选得到的核心靶蛋白导入DAVID 数据库进行GO 生物学过程富集分析,即分别从生物过程、细胞组分及分子功能3 个层面对基因功能进行注释。GO 富集分析结果显示,妇可靖治疗慢性盆腔炎的靶基因主要富集在138 个生物学过程,56 种细胞组分和54种分子功能。按照重要性由高到低进行排序,主要生物学过程富集结果见图3,细胞组分及分子功能富集分别见图4～5。由此可见,药物治疗疾病的生物过程主要涉及基因、蛋白及核糖体等小分子代谢过程的调节,这些靶点在细胞组分中与胞核、胞质以及胞膜等相关性最大,在分子功能中与ATP 等能量结合、DNA 等基因结合及蛋白质结合等相关性最大。

图3 GO 富集分析的生物过程

图4 GO 富集分析的细胞组分

图5 GO 富集分析的分子功能

2.4 妇可靖胶囊“成分-靶点-通路” 网络模型构建 采用Cytoscape 软件构建妇可靖胶囊“活性成分-靶点-通路” 网络模型,见图6,其作用靶点分布于不同的代谢通路,相互协调,相互关联,从多种途径体现药物治疗盆腔炎的作用机制。

3 讨论

本研究基于网络药理学对中药复方进行深入研究,通过“活性成分-靶点预测-疾病” 关系网络的构建、拓扑参数的分析及生物信息的挖掘对妇可靖胶囊治疗女性盆腔炎在整体分子水平上阐述作用机制,打破“一个药物一个靶标” 的传统研究理念,为临床上研究中药多成分、多靶点、多通路提供重要的借鉴思路［10-11］。通过设置筛选条件后共得到妇可靖胶囊的主要活性成分91 种,作用靶点共154 个,通过网络拓扑分析得到其治疗慢性盆腔炎的关键核心靶点797 个。KEGG 分析显示药物作用靶点主要富集于MAPK、TNF、NOD 样受体,Toll 样受体以及T 细胞受体信号通路等关键途径,尤以NOD/ NF-κB/TNF 通路密切相关。NOD 样受体是表达于固有免疫细胞表面的一种受体蛋白,其介导的炎症信号通路在机体抗感染免疫应答中具有重要作用。NOD 样受体主要通过介导NF-κB 通路、MAPK 通路和自噬通路参与抗细菌免疫应答,在胞外刺激物的诱导下,能调控相关促炎基因如IL-1β 和TNF-α 的转录和表达,导致其大量产生,引发一序列的炎症损伤［12-13］；淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群,T 细胞可分化为具有不同生物学功能的细胞亚群以协助协助和动员其它免疫细胞一起清除体内入侵的病原体。妇可靖胶囊可能主要通过干预NOD 样受体主介导下游MAPK 与NF-κB 蛋白靶点激活TNF通路,调节TNF-α、IL-1β、IL-6 等一系列炎性因子,抑制子宫内膜炎症细胞增生,起到治疗慢性盆腔炎的作用。

图6 妇可靖胶囊“成分-靶点-通路” 网络图

妇可靖胶囊潜在作用靶点前列腺素-内环氧合酶(PTGS),是前列腺素合成的关键酶,同时为非甾体抗炎药物作用靶点；MMP9 与血管内皮生长因子的产生关系密切,MMP2 能够裂解各种胶原蛋白及黏连蛋白,靶点基因体现了妇可靖胶囊“逐瘀清化” 的特点［14］；CCL2 属于趋化因子,一类同时参与免疫调节和炎症过程的分泌蛋白家族。这体现了妇可靖胶囊治疗盆腔炎“清热解毒” 的药物特点［15］。本研究结果显示,KEGG 富集分析得出的妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎通路与靶点与免疫炎症高度相关,这与化学成分研究结果相吻合。

慢性盆腔炎的发病机制与病理因素极其复杂,而传统的“单成分-单靶点-单疾病” 模式并不适合中药复方制剂研究。网络药理学基于“药物靶点网络-疾病基因网络-蛋白蛋白互作网络” 从整体水平上探索并阐释药物治疗疾病的复杂作用机制,可以更加直观地理解妇可靖胶囊和慢性盆腔炎的相互作用。本研究基于网络药理学理念,构建“成分-靶点-疾病” 网络,初步分析妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的药效物质基础及可能的作用机制,为下一步更深入地分子机制验证及研究奠定了扎实可靠的前期基础。