基于网络药理学探讨白芍治疗贫血的机制

2021-03-25叶先文邓亚羚任洪民夏澜婷陈宇帆张金莲余亦婷

中成药 2021年3期

叶先文，邓亚羚，任洪民，夏澜婷，杨明，陈宇帆，张金莲*，余亦婷

(1.江西中医药大学药学院，江西南昌 330004；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004；3.赣州市人民医院，江西赣州 341000）

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根,具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳等功效,临床常用于治疗月经不调、胁痛、腹痛等症［1］,为补血常用药。白芍主要化学成分有芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸等［2］。

网络药理学是一门新兴的药理学探究技术,其分子对接及探究药物与靶点之间关系的方法符合传统中医治疗及辨证论治的理念［3］。本文利用各种在线数据库资源,通过网络药理学的研究方法(图1),结合TCMSP 等数据库预测药效成分靶点,使用Cytoscape 3.6.1 软件建立关于白芍治疗贫血的药物-成分-靶点-通路-疾病网络。

1 材料与方法

1.1 白芍化学成分数据来源 TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/index.php) 是一个独特的中草药系统药理学台,能够搜索药物、靶点和疾病之间的关系,该数据库提供口服生物利用度(OB)、类药性(DL)、血脑屏障(BBB)等天然化合物的药代动力学特性［4］。本文以“白芍” 为关键词进行搜索,对搜索成分的结构以Mol2 格式进行保存,通过Chemspider(http://www.chemspider.com/)及Scifinder(https://www.cas.org/prod ucts/scifinder) 对其结构进行验证。

1.2 贫血相关靶点获取 GeneCards 是一个可搜索的、免费的、综合的数据库,给用户提供注释和预测人类基因的全面信息,它自动集成了来自约150 个web 源的以基因为中心的数据,包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传学、临床和功能信息［5］。DisGeNET、Pubmed 同样可对疾病基因进行搜索,以 “Anemia” 为关键词,数据库类型为“Gene”,物种限定为“Homo sapiens”,对“贫血” 相关基因进行搜索。

1.3 数据预处理

1.3.1 白芍生物活性成分筛选目前活性成分常采用生物口服利用度OB ＞30% 和类药性DL ＞0.18 的规则进行筛选［6］,将结果以Excel 格式保存。

图1 网络药理学研究思路

1.3.2 白芍生物活性成分-靶点预测基于配体预测,通过Swiss TargrtPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) (P＞0.5)、Stitch (http://stitch.embl.de/) 预测靶点,收集DrugBank (https://www.drugbank.ca/) 的靶点。Swiss TargrtPredict［7］通过二维和三维相似度,与一个包含28 万个化合物的文库进行了比较,进而对小分子靶点进行预测,这些化合物对5 种不同生物体的二千多个目标物都有效。Stitch［8］可以根据单个蛋白质名称、多个名称或氨基酸序列,随机选择至少具有4 个预测链接的蛋白质,预测链接的可信度中等或更好。DrugBank［9］(药物库数据库)是一个全面的、可免费访问的在线数据库,包含有关药物和药物靶标的信息。通过上述数据库,将成分-靶点整理成Excel 表格。

1.3.3 预测靶点的标准化 UniProt［10］(https://www.uniprot.org/) 为科学界提供全面、高质量和可自由获取的蛋白质序列和功能信息资源。通用蛋白质资源(UniProt) 是一种蛋白质序列和注释数据的综合资源,它是UniProt 知识库(UniProtKB)、UniProt 引用集群(UniRef) 和UniProt 归档(UniParc) 的集合。将预测的靶标蛋白通过UniProt 转化为基因名称,物种限制为“Human”,建立蛋白-基因文档。

1.4 PPI 网络构建机体内在的生物过程并不是由单一信号调控的,一个基因/蛋白的表达和功能往往受多个基因的影响［11］,PPI 网络是靶标蛋白之间的相互作用网络［12］。为探索白芍治疗贫血的作用机制,将获得的靶点上传于String Version:11.0 (https://string-db.org/),构建了PPI 网络。String 结合不同证据通道的概率计算综合得分,并对随机交互的概率进行校正,最低评分为0.4 时为中等可信度,0.7 表示高可信度,0.9 表示最高可信度［13］,本研究选用了评分为0.4 的PPI 网络,即中等可信度网络。

1.5 GO 和KEGG 通路的富集分析 WebGestalt (http://www.webgestalt.org/option.php) 是一个功能丰富的Web分析工具。它于2019 年1 月14 日更新,涵盖354 个数据库,支持12 种生物,321 251 种功能分类。它能够分析数据库中没有的基因或来自实验的生物的数据。该平台可将蛋白质功能分为生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF) 等,本研究中,选择BP、CC 和MF 进行富集显示［14］。Cytoscape3.6.1 (https://cytoscape.org/) 是一个开源软件平台,能够对分子间相互作用网络和生物通路集成这些网络的注释、基因表达谱等状态数据进行可视化处理,该软件插件ClueGO 可对关键靶点进行生物过程GO及通路分析,将结果以png 及xls 格式保存。

1.6 分子对接验证 Discovery Studio 软件是一款包含生物大分子三维结构预测与模拟、药物设计等领域的软件,被广泛运用于小分子配体与生物大分子间相互作用的表征、同源建模、分子力学计算等方面,通过该软件可进行分子对接验证［15-16］。

1.7 药物-成分-靶点-通路-疾病网络构建将上述试验获得的药物-成分、靶点-通路等网络导入Cytoscape 中,利用“Tool” 功能项下的“merge” 功能进行网络合并,得到药物-成分-靶点-通路-疾病网络。

2 结果

2.1 白芍化学成分及活性成分筛选通过TCMSP 数据库进行化学成分收集,共85 种成分,符合OB＞30%、DL＞0.18 的有13 种。文献表明,芍药苷和芍药内酯苷为白芍治疗贫血的物质基础［17］,没食子酸具有抗炎抗氧化、抗肿瘤等作用［18］,因此将15 种成分作为候选活性物质(表1),通过Scifinder 和Chemspider 对其结构进行验证。

表1 白芍候选成分

2.2 白芍活性成分-靶点构建通过Swiss TargetPrediction(P＞0.5)、Stitch 预测的靶点个数分别为80、30,DrugBank中搜集的靶点91 个,paeoniflorin＿ qt 所预测靶点的P值均小于0.5,故不考虑此成分及靶点。去除重复项,获得靶点161 个,将靶点导入Cytoscape 中,获得成分-靶点图(图1A)。

2.3 贫血-靶点 PPI 网络构建通过 GeneCards、DisGeNET、Pubmed 分别获取贫血相关基因4 278、489、545 个,合并去重复得4 864 个,构建疾病-靶点网络(图1B)。上传成分-靶点、疾病-靶点于Venny2.1 (https://string-db.org/) 网络在线服务器中,获得共有靶点96 个(图1C)。将共有靶点导入String Version:11.0 (https://string-db.org/),构建评分0.4 的PPI 网络(图1D),去除不满足评分的靶点,该网络有靶蛋白94 个。通过DisGeNET［19］(http://www.disgenet.org/),对获得的14 个核心靶蛋白进行了属性整理(表2),发现这些靶点的类别可分为激酶、信号因子、转移酶、水解酶、蛋白酶等。在PPI网络中,IL6 (54)、TP53 (47)、TNF (40)、CASP3(38)、MAPK8 (36) 为度值排前五的靶蛋白,可能是治疗贫血的关键靶点。

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.4.1 GO 功能富集提取核心交互靶点14 个,通过WebGestalt 进行生物功能富集,得到43 个GO 富集结果(图1F),在BP 中,以代谢过程(metabolic process；14/14)、应激反应(response to stimulus；14/14)、生物调节(biological regulation；14/14) 最为显著；在CC 中,以膜封闭腔(membrane-enclosed lumen；11/14)、膜(membrane；10/14) 最为显著；在MF 中,蛋白质结合(protein binding；14/14)、离子结合(ion binding；9/14) 可能是关键的分子功能。除此之外,还通过ClueGO 插件对其进行了更加深入的GO 生物功能分析 (表3),认为负调控脂质储存(negative regulation of lipid storage)、正调控急性炎症反应(positive regulation of acute inflammatory response)、正调控DNA 模板转录(positive regulation of DNA-templated transcription)、RNA 聚合酶 II 转录 pri-miRNA (pri-miRNA transcription by RNA polymerase II) 为显著的生物过程。

表2 共有靶点属性

表3 生物功能富集

2.4.2 KEGG 通路富集对14 个核心靶点进行了通路富集,获得了显著的前10 个通路(图1G),IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路 (AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF 信号通路(TNF signaling pathway) 可能为关键通路,百日咳(Pertussis)、乙型肝炎(Hepatitis B) 也可能影响贫血的发生发展,详细信息见表4,IL-17信号通路图见图2。

表4 KEGG 信号通路富集

图2 IL-17 信号通路

2.5 分子对接验证采用Discovery Studio 2016 的LibDock模块,基于白芍活性成分进行分子对接验证,以成分-核心靶点对接打分构建热图(图3)。热图分析发现,除本文预测的成分-核心靶点之间具有较好的结合能力外,其他活性成分与核心靶点也有较好的结合能力。

2.6 药物-成分-靶点PPI-通路-疾病网络构建通过Cytoscape 构建药物-成分-靶点PPI-通路-疾病网络(图4),包括36 个节点,186 条边,从左至右依次表示白芍、成分、靶点、通路、贫血。在构建网络图中,11α,12α-环氧-3β-23-二羟基-30-去甲齐墩果-20-烯-28,12β-内酯、苯甲酰芍药苷、白桦脂酸、芍药苷元、丹皮酚原苷未与核心靶点对接,所以不在图中显示。

3 讨论

本文通过TCMSP 获得白芍化学成分85 种,OB 和DL值筛选出活性成分15 种,基于该活性成分预测靶点161个,与疾病基因配对且符合评分0.4 的PPI 网络的靶点94个,通过“DC＞2×度值” 筛选出核心靶点14 个,分子对接结果显示,多数白芍活性成分与核心靶点具有较好的结合能力。我们对其中的靶点进行了文献检索,TP53 在癌症治疗方面有广泛的研究［20-21］,参与了多种细胞死亡通路,且可作为信号中心评估神经元损伤情况［22］；MAPK8 能够通过激活MAPK 信号通路,促进细胞增殖,抑制胶质瘤细胞凋亡［23］,且MAPK 通路参与了再生性障碍贫血的治疗［24-25］；TNF 和IL6 参与了慢性病贫血/缺铁性贫血的发生和发展［26］,且TNF 表达可反映再生障碍性贫血患者疾病程度［27］,白芍可通过IL3 和TNF 对环磷酰胺致血虚小鼠起到缓解作用［28］,这些靶蛋白可能为白芍治疗贫血的关键靶点,提示细胞-神经网络可能是关键途径。

图3 成分-核心靶点对接打分热图

在43 个GO 富集中,多为细胞增殖与凋亡、能量代谢、应激反应等。负调控脂质储存(negative regulation of lipid storage) 可能为白芍治疗贫血的关键生物过程,研究表明,患有贫血和缺铁性贫血的老人血脂较正常人显著降低［29］,贫血患者的脂蛋白水平明显低于非贫血患者,且与贫血的严重程度成正比,贫血类型对血脂无明显影响［30］。贫血可能通过改变巨噬细胞功能增加肠道炎症和屏障破坏［31］,炎症诱导的细胞因子和铁稳态的主调节因子阻碍了肠道铁的吸收,并导致网状内皮细胞铁潴留,导致铁限制红细胞生成。此外,缩短红细胞半衰期,抑制促红细胞生成素对贫血的反应,以及炎症介质抑制红细胞分化,这些都进一步促进了炎症性贫血的特异性模式［32］。细胞循环参与了贫血的过程,表明在基因调控上,正调控DNA 模板转录(positive regulation of DNA-templated transcription)、RNA聚合酶II 转录pri-miRNA (pri-miRNA transcription by RNA polymerase II) 也可能为关键的基因调控途径［33］。

在10 个 KEGG 通路中,IL-17 信号通路 (IL-17 signaling pathway)、糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF 信号通路(TNF signaling pathway) 可能为关键通路。晚期糖基化终产物是由蛋白质、脂类和核酸在非酶糖基化和氧化过程中产生的一组复杂化合物,AGE 和RAGE 的相互作用会导致氧化应激、炎症反应和血栓形成,从而参与血管老化和损伤［34］。IL-17 信号通路［35］(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路［36］(TNF signaling pathway) 等也与贫血有关。不仅如此,百日咳(Pertussis)［37］、乙型肝炎(Hepatitis B)［38］等疾病也可能参与了贫血的发生发展。