田淋淋，徐 云，林建梅，高 嵩，崔宪利，徐 建*

(1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室，吉林 长春 130103；2.吉林长白山药业集团股份有限公司，吉林 白山 134300）

肝胆双清口服液由熊胆粉、牡丹皮、半枝莲等8 味中药组成,具有清热利胆、调理气血的功效,临床用于肝胆湿热、气血不调所致胁肋隐痛、口干、口苦、食少乏力等症状的辅助治疗,效果显著。但原工艺处方中牡丹皮、当归采用水蒸气蒸馏法收集的蒸馏液后,直接加入其余药味提取的浓缩液中,存在有效成分稳定性及水溶性差、口感不好等缺点。

为了克服上述缺点,本实验选用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD) 作为包合材料［1-3］,将肝胆双清口服液中丹皮酚、当归挥发油制成包合物,在提高稳定性的同时增加溶解度。再采用Box-Behnken 响应面法优化包合物制备工艺,以期为工业化生产提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器 U3000 型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；MS205DU 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；挥发油提取器(北京玻璃仪器厂)；ETS-D5 型恒温磁力搅拌器(艾卡仪器设备有限公司)；新之冷冻冻干机。

1.2 试剂与药物 牡丹皮(批号2017-08-09-6)、当归(批号2017-09-01-8) 均由吉林长白山药业集团股份有限公司提供,经长春中医药大学张辉教授鉴定为正品,符合2015 年版《中国药典》 标准。HP-β-CD (批号181201) 购自辽宁禄泉医药科技有限公司。乙醇、石油醚、盐酸均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 丹皮酚提取 取牡丹皮饮片100 g,加入10 倍量水浸泡0.5 h,水蒸气蒸馏法收集6 倍量馏出液,加入1 mol/L盐酸溶液调节pH 至2～3,在4 ℃下放置24 h,滤过,结晶用水洗涤,35～38 ℃下低温干燥,研成细粉,即得。

2.2 当归挥发油提取 取当归饮片200 g,加入7 倍量水浸泡0.5 h,按2015 年版《中国药典》 四部通则2204 项下挥发油测定法［4］收集挥发油。

2.3 包合物制备 以乙醇为溶剂,采用饱和溶液法进行包合。称取一定量HP-β-CD,加入适量乙醇使其成饱和溶液,置于磁力搅拌器中(转速2 600 r/min),设置适当温度使其溶解。另称取丹皮酚结晶细粉、当归挥发油各1 g,适量乙醇溶解,缓慢加到HP-β-CD 乙醇溶液中搅拌,减压回收乙醇后常温干燥,石油醚等量洗涤3 次,挥干溶剂,即得。

2.4 包合率、包合物收率测定

2.4.1 丹皮酚含量测定 按照中国药典2015 年版《中国药典》 四部通则0512［5-8］,采用HPLC 法测定。

2.4.1.1 色谱条件与系统适用性试验 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相甲醇-水(45 ∶55)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长274 nm。理论塔板数按丹皮酚计,应不低于3 000。

2.4.1.2 对照品溶液制备 精密称取丹皮酚对照品适量,流动相制成每1 mL 含0.3 mg 该成分的溶液,即得。

2.4.1.3 供试品溶液制备 取包合物约1 g,精密称定,置于100 mL 量瓶中,精密加入乙醇适量,密塞,超声(250 W、50 kHz) 处理30 min,放冷,乙醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.4.1.4 线性关系考察 精密量取丹皮酚对照品溶液(1.503 0 mg/mL) 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,置于5 mL 量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇 匀,滤 过,在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y),丹皮酚质量浓度为横坐标(X) 进行回归,得方程为Y=415.46X+1.479 2(R2=0.999 9),在0.150 4～1.202 4 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.4.1.5 精密度试验 精密吸取“2.4.1.2” 项下对照品溶液,在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得丹皮酚峰面积RSD 为0.96%,表明仪器精密度良好。

2.4.1.6 稳定性试验 取“2.4.1.3” 项下供试品溶液,于0、2、4、8、12、18、24 h 在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得丹皮酚峰面积RSD 为0.34%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.1.7 重复性试验 取同一份包合物,共6 份,按“2.4.1.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得丹皮酚含量RSD 为0.57%,表明该方法重复性良好。

2.4.1.8 加样回收率试验 取丹皮酚含量已知的包合物6份,每份0.5 g,加入丹皮酚对照品溶液(1.503 0 mg/mL)13 mL,按 “2.4.1.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,丹皮酚平均加样回收率为99.78%,RSD 为0.76%。

2.4.2 丹皮酚包合率测定 称取丹皮酚结晶、包合物,测定该成分含量,计算包合率,公式为包合率=(包合物中丹皮酚含量/丹皮酚总投药量) ×100%。

2.4.3 当归挥发油包合率测定 取包合物适量,按2015年版《中国药典》 四部通则2204 项下挥发油测定法提取挥发油,读取体积,计算包合率,公式为包合率=(包合物中挥发油含量/挥发油加入量)×100%。

2.4.4 包合物收率测定 公式为收率=［包合物质量/(环糊精加入量+丹皮酚加入量+挥发油加入量)］ ×100%。

2.4.5 综合评分计算 以丹皮酚、当归挥发油包合率及包合物收率的综合评分为评价指标［9-12］。其中,包合率为衡量包合效果的主要指标,其数值越高,挥发油包合效果越好,故将其作为主要指标,权重系数设定为0.8；包合物收率在实际生产过程中也有重要意义,在投入量一定的情况下其数值越高,包合率越高,故将其作为次要目标,权重系数设定为0.2。牡丹皮中丹皮酚包合率权重系数设定为0.7,当归挥发油包合率权重系数设定为0.3。将丹皮酚包合率、当归挥发油包合率分别用A1、A2表示,包合物收率用B表示,计算综合评分,公式为综合评分=A1×0.56(0.8×0.7) +A2×0.24 (0.8×0.3) +B×0.2。

2.5 包合工艺优化

2.5.1 单因素试验

2.5.1.1 投料比 称取HP-β-CD 8 g (4 ∶1)、12 g (6 ∶1)、16 g (8 ∶1)、20 g (10 ∶1)、24 g (12 ∶1),加入适量乙醇使其成饱和溶液,置于磁力搅拌器中 (转速2 600 r/min),水浴温度45 ℃。分别称取丹皮酚结晶细粉、当归挥发油1 g,各5 份,适量乙醇溶解,缓慢加入HP-β-CD 乙醇溶液搅拌2 h,减压回收乙醇后常温干燥,石油醚等量洗涤3 次,挥干溶剂,测定丹皮酚、当归挥发油包合率及包合物收率,计算综合评分,结果见图1。由此可知,随着投料比增加,综合评分逐渐升高,达到8 ∶1 后程度趋缓,故选择8 ∶1 作为最优投料比。

图1 投料比对综合评分的影响

2.5.1.2 包合温度 称取HP-β-CD5 份,每份20 g,加入适量乙醇使其成饱和溶液,置于磁力搅拌器中 (转速2 600 r/min),水浴温度35、40、45、50、55 ℃。分别称取丹皮酚结晶细粉、当归挥发油1 g,各5 份,适量乙醇溶解,缓慢加入HP-β-CD 乙醇溶液搅拌2 h,减压回收乙醇后常温干燥,石油醚等量洗涤3 次,挥干溶剂,测定丹皮酚、当归挥发油包合率及包合物收率,计算综合评分,结果见图2。由此可知,包合温度为40 ℃时综合评分最高,故选择40 ℃作为最优包合温度。

图2 包合温度对综合评分的影响

2.5.1.3 包合时间 称取HP-β-CD5 份,每份20 g,加入适量乙醇使其成饱和溶液,置于磁力搅拌器中 (转速2 600 r/min),水浴温度45 ℃。分别称取丹皮酚结晶细粉、当归挥发油1 g,各5 份,适量乙醇溶解,缓慢加入HP-β-CD 乙醇溶液搅拌0.5、1、2、3、4 h,减压回收乙醇后常温干燥,石油醚等量洗涤3 次,挥干溶剂,测定丹皮酚、当归挥发油包合率及包合物收率,计算综合评分,结果见图3。由此可知,随着包合时间延长,综合评分逐渐升高,在2 h 后基本稳定,故选择2 h 作为最优包合时间。

2.5.2 Box-Behnken 试验 在单因素试验基础上,以投料比(HP-β-CD 与丹皮酚、当归挥发油) (A)、包合温度(B)、包合时间(C) 为影响因素,综合评分(Y) 为评价指标,设计三因素三水平试验［13-16］。因素水平见表1,结果见表2。

图3 包合时间对综合评分的影响

表1 因素水平

表2 试验设计及结果

采用Design-Expert8.0.6 软件进行二次多元回归拟合,得方程为Y=81.08+3.11A+0.80B+0.80C-0.47AB+0.37AC-0.27BC-2.45A2-3.45B2-1.50C2,方差分析见表3。由此可知,模型P＜0.01,表明有极显著意义；失拟项P=0.801 5＞0.05,表明失拟项不显著；因素A(投料比)的一次项、二次项均有极显著意义(P＜0.01)；各因素影响程度为依次为A(投料比) ＞C(包合时间) ＞B(包合温度)。

表3 方差分析

响应面分析见图4。由此可知,在包合温度、包合时间不变时,综合评分随着投料比增加而升高,达到8 ∶1 后程度趋缓；在投料比、包合温度不变时,随着包合时间延长综合评分升高,但程度不明显；当投料比、包合时间不变时,随着包合温度增加综合评分先升后降,在40 ℃时达到最大。最终确定,最优工艺为投料比8 ∶1,包合温度40 ℃,包合时间1 h,综合评分为81.08 分。

图4 各因素响应面图

2.6 验证试验 按优化工艺进行3 批验证试验,结果见表4,可知综合评分与预测值81.08 分基本一致,表明该工艺稳定可行。

表4 验证试验结果（n=3）

3 讨论

当归挥发油、丹皮酚均具有挥发性,难溶于水,而且易损失,为了增加肝胆双清口服液稳定性,提高其生物利用度,本实验采用包合技术将上述2 种成分一起包合。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD) 是应用最广泛β-环糊精衍生物,在保持环糊精空腔的同时克服了β-环糊精水溶性差的主要缺点,是目前研究较全面、安全性较高、水溶性较好的包合材料,是用于口服液包合的最佳选择,故本实验选择其对当归挥发油、丹皮酚进行包合。

然后,本实验采用Design-Expert8.0.6 软件,通过Box-Behnken 响应面法优化肝胆双清口服液中丹皮酚、当归挥发油包合物制备工艺,发现投料比对综合评分的影响最显著,而且包合温度、包合时间均受其影响。最终确定,最优制备工艺为投料比8 ∶1,包合温度40 ℃,包合时间1 h,综合评分为81.78 分,与预测值81.08 分基本一致,表明结果真实可靠,工艺稳定可行。