刘潇雯，吕伟旗，陈伟东，吴春美

(丽水市人民医院药学部，浙江 丽水 323000）

细叶小檗Berberis poiretiiSchneid.系小檗科小檗属落叶灌木,其干燥根入药,俗称“三颗针”,性寒,味苦,归肝、胃、大肠经,具有清热燥湿、泻火解毒的功效,用于湿热泻痢、黄疸、湿疹、咽痛目赤、聤耳流脓、痈肿疮毒等［1］。其干燥根中含有小檗碱、小檗胺、掌叶防己碱和药根碱等多种生物碱,具有抗心肌缺血、抑菌、镇痛、降血糖等药理活性［2-5］。药用植物由于地理分布、栽培方式、生境因子等不同,导致药材质量参差不齐,影响着临床用药疗效与安全［6-7］。目前,针对细叶小檗的报道主要集中在果实化学成分［8］、制备工艺［9-10］、显微构造［11］与药理研究［12-13］等,而对不同产地药材中盐酸小檗碱含量测定鲜有报道。本研究收集6 省13 个产地细叶小檗种质资源,建立HPLC 法测定根中盐酸小檗碱含量,分析其与生长性状、经纬度、海拔间的相关性,并进行聚类分析,以期为该药材质量控制与优良种质筛选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药材 2019 年9 月至2019 年10 月采集吉林、河北、重庆、湖南、陕西、云南等省市13 个细叶小檗新鲜种质资源,经丽水市人民医院吴春美主任药师鉴定为小檗科落叶灌木细叶小檗Berberis poiretiiSchneid.,信息见表1。

1.2 仪器与试剂 600-2998 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；KQ-1500VDB 台式超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；XPR 分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；小型多功能粉碎机(拜杰仪器有限公司)；101-1SB 烘箱(上海向北实业有限公司)；盐酸小檗碱(YZ-110713,北京索莱宝科技有限公司)；色谱乙腈 (美国Tedia 公司)；其他甲醇等试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.3 方法

1.3.1 生长性状考察 每个产地取细叶小檗新鲜植株15 株,纯水洗净,用滤纸吸干水分,阴干,用米尺测量株高、主根长,用电子天平称量根系鲜重,每株随机取3 片叶,用直尺测量叶长与叶宽,计算叶长宽比=叶长/叶宽。

1.3.2 盐酸小檗碱含量测定

1.3.2.1 色谱条件 YMC-Pack Polymer C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液；体积流量1.0 mL/min；检测波长265 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 盐酸小檗碱HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride

1.3.2.2 线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱标准品适量,制备质量浓度分别为6.5、13、19.5、26、32.5、65 μg/mL 的对照品溶液,在“1.3.2.1” 项色谱条件下进样,记录峰面积,以峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X)进行回归,得回归方程为Y=196.78X+123.3 (r=0.999 9),表明盐酸小檗碱在6.5～65 μg/mL 范围内线性关系良好。

1.3.2.3 样品含量测定 将细叶小檗根系洗净除去须根,主根切片,65 ℃烘干至恒定质量,粉碎过60 目筛。精密称取粉末0.1 g 至50 mL 圆底烧瓶中,加20 mL 甲醇,封口,称定质量,室温下超声(250 W,40 kHz) 提取1 h,放冷,甲醇补足减失质量,抽滤,滤液定容至25 mL 棕色量瓶中,即得供试品溶液。在“1.3.2.1” 项色谱条件下进样,测定样品峰面积,平行3 次。

1.3.2.4 精密度试验 取盐酸小檗碱标准品溶液适量,在“1.3.2.1” 项色谱条件下测定峰面积,试验平行6 次,测得峰面积RSD 为0.87%,表明仪器精密度良好。

1.3.2.5 稳定性试验 取陕西周至样品,按“1.3.2.3” 项下方法 制备供试品溶液,在“1.3.2.1” 项色谱条件下,分别于室温遮光放置0、2、4、8、10、12、24 h 后进样,测定峰面积,测得峰面积RSD 为1.39%,表明供试品溶液在室温遮光条件下24 h 内稳定性良好。

1.3.2.6 重复性试验 取陕西周至样品6 份,按“1.3.2.3” 项下方法 制备供试品溶液,在“1.3.2.1” 项色谱条件下测定峰面积,测定样品中盐酸小檗碱平均含量为7.84 mg/g,RSD 为2.32%,表明该方法重复性良好。

1.3.2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的陕西周至样品适量,加入盐酸小檗碱对照品,在“1.3.2.1” 项条件下进样,测定样品含量,计算加样回收率,试验平行3 次,结果见表2。

表2 盐酸小檗碱加样回收率试验结果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests for berberine hydrochloride （n=3）

1.4 数据分析 用SPSS 23.0 与Excel 2010 软件进行数据处理,采用单因素ANOVA 分析,聚类分析采用组间联接法［14］。

2 结果

2.1 生长性状 13 个产地细叶小檗生长性状存在差异(*P＜0.05 或**P＜0.01),根长与根重变幅分别为0.84～1.43 m 与24.63～45.89 g,其中湖南蓝山细叶小檗根长、根重、株高、叶宽指标数值最大,分别为1.43 m、45.89 g、2.04 m 与1.18 cm,其叶片最为宽钝,叶长宽比最低,仅为2.81；湖南雨花细叶小檗叶片最长,叶长达3.48 cm,河北涿鹿细叶小檗叶片最为狭长,叶长宽比为4.12,见表3。

表3 不同产地样品生长性状与盐酸小檗碱含量比较（n=15）Tab.3 Comparison of growth traits and berberine hydrochloride contents of samples from different growing areas（n=15）

2.2 盐酸小檗碱含量 13 个产地细叶小檗中盐酸小檗碱含量存在差异 (P＜0.01),平均含量为9.45 mg/g,变幅为6.24～12.93 mg/g。从盐酸小檗碱含量看,13 个产地盐酸小檗碱含量均满足2020 年版《中国药典》 规定不低于6 mg/g 的标准,表明供试细叶小檗药材质量良好。13 个产地中,吉林与河北样品盐酸小檗碱含量较高,重庆与湖南样品含量次之,陕西与云南样品含量较低,其中吉林东昌含量最高,达12.93 mg/g,是其他样品的1.07～2.07 倍,而云南宜良样品含量最低,仅为6.24 mg/g,见表3。

2.3 相关性分析 盐酸小檗碱含量与生长性状、经纬度、海拔关系密切,与叶长宽比、经度、纬度呈正相关关系,其中经度正相关系数最高,达0.894 4,而与根长、根重、株高、叶长、叶宽、海拔呈负相关关系,其中海拔负相关系数最高,为-0.650 3。结果显示,在供试经纬度与海拔范围内,高经纬度、低海拔种植细叶小檗有利于其根中盐酸小檗碱含量积累,而通过生长性状筛选高盐酸小檗碱含量的细叶小檗优良品系时,可优先在叶片狭长(高叶长宽比) 的矮状株系中选择,见表4。

表4 盐酸小檗碱含量与生长性状、生境因子间的相关性Tab.4 Correlation analysis between berberine hydrochloride contents and growth traits and habitat factors

2.4 聚类分析 以盐酸小檗碱与生长性状为划分依据,按欧式距离D2=16.97 的标准将13 个产地细叶小檗划分为3 个类群,见图2。第Ⅰ类群共5个种质,分别为吉林磐石、河北抚宁、吉林东昌、河北涿鹿、河北赤城,此类群细叶小檗植株较矮,根系不发达,根产量低,叶片小而狭长,根中盐酸小檗碱含量高；第Ⅱ类群共4 个种质,分别为重庆南川、重庆北碚、陕西周至与陕西汉阴,此类群细叶小檗植株中等高度,根系不发达,根产量低,叶片中等大小,叶型较宽钝,根中盐酸小檗碱含量较低；第Ⅲ类群共4 个种质,分别为云南宜良、云南西山、湖南雨花与湖南蓝山,此类群细叶小檗植株较高,根系发达,根产量高,叶片多大而宽钝,其中湖南种质盐酸小檗碱含量中等,但云南种质盐酸小檗碱含量较低。

图2 13 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of thirteen batches of samples

3 结论与讨论

盐酸小檗碱是2020 年版《中国药典》 规定的细叶小檗主要质量评价指标,具有抗菌消炎、清热解毒、镇痛等功效［15］。本实验考察了提取溶剂(甲醇、95%甲醇、乙醇)、提取方法(超声、索式提取、加热回流)、提取时间(40、60、80 min)、流动相(乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钾) 及检测波长,发现以甲醇为提取溶剂,室温下超声(250 W,40 kHz) 1 h 即可提取完全。结果表明,6 省13 个产地细叶小檗中盐酸小檗碱含量存在差异(P＜0.01),其中吉林与河北样品含量最高,陕西与云南样品含量最低；经度、纬度、海拔、株高与盐酸小檗碱含量关系密切,在供试经纬度与海拔范围内,高经纬度、低海拔种植细叶小檗有利于其根中盐酸小檗碱含量积累,从盐酸小檗碱含量看,细叶小檗优良种质可优先在高经纬度、低海拔地区的吉林、河北种质中选择,而从根产量看,可优先在云南与湖南种质中选择。药用植物在生长发育过程中受诸多环境因素影响,而各环境因素间往往具有关联性［16］,本研究将进一步开展不同种质在同一区域(不同海拔) 栽培试验,以期选育出高品质、高产量的细叶小檗优良品系。除盐酸小檗碱外,细叶小檗中巴马汀、小檗胺、β-谷甾醇也具有抗菌、抗肿瘤等活性［17-18］,故在细叶小檗药材质量评价体系建立中应综合考虑上述成分。此外,每个产地只取了1～2 份样品,区域代表性不强,其他分布区(如贵州、广西等地) 未收集到种质,后续将加强对上述产地种质资源收集,以期完善种质资源库,为优良品种选育奠定基础。