刘 锟，王健英，魏 莉，潘颖宜，袁 颖*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学协同创新中心，上海 201203）

杜仲Eucommiaul moidesOliv.为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木,是我国特有的常用中药材。其干燥树皮药用,具有补肝肾、强筋骨、安胎等作用［1］,《神农本草经》 将其列为上品,在我国已有两千多年药用历史,但因杜仲树皮达到药用的生长周期长,且不可再生等,导致杜仲药用资源紧缺［2］。现代研究［3-4］表明杜仲富含木脂素、苯丙素、黄酮、环烯醚萜、三萜等成分,具有降血脂、降血压［5］、降血糖［6］、抗骨质疏松［7］、抗肿瘤［8］、抗菌［9］、抗炎［10-11］等药理作用,且杜仲不同药用部位的各成分含量有所差异［12-14］。但课题组尚未见国内外对杜仲皮、叶和雄花3 个药用部位的成分进行比较的研究报道。故本实验拟比较杜仲皮、叶、雄花中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素和白桦脂酸8 种成分含量的差异,以期为杜仲的质量控制,药用资源的拓展以及药理作用的物质基础的阐述提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 系统,配置四元泵、DAD检测器、柱温箱、自动进样器、色谱工作站、gilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Agilent 公司)；MIKRO 220R低温离心机(德国MIKRO 公司)；BSA124S 分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；SQP 分析天平(十万分之一,赛多利斯科学仪器北京有限公司)；SK7200HP 超声波清洗仪(上海科寻超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花信息见表1,经上海中医药大学中药学院生药教研室吴靳荣副教授鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommiaul moidesOliv.的干燥树皮、叶、雄花。桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、白桦脂酸对照品(批号分别 为 B21238、B20635、B21661、B20636、B21213、B20782、B20527、B20041,质量分数≥98%,上海源叶生物科技有限公司)；甲醇、甲酸(批号分别为20170812、A117-50,色谱级,国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(批号B9012-03,色谱级,北美J.T.Baker 公司)；水为娃哈哈纯净水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 用于检测7 种成分供试品溶液 取干燥杜仲皮、叶打粉,过40 目筛,精密称取样品各1.00 g,加入50%甲醇溶液25 mL 并充分混匀,静置30 min 后再超声提取30 min,于4 ℃6 000 r/min条件离心3 min 后取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液即得(4 ℃条件下存放)。精密称取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制备得供试品溶液。

2.1.2 用于检测白桦脂酸供试品溶液 取干燥杜仲皮、叶打粉,过40 目筛,精确称取各样品1.00 g,加入75% 甲醇25 mL 并充分混匀称定质量,然后回流提取1 h 并补足减失质量,于4 ℃6 000 r/min 条件离心3 min 后取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,再取续滤液即得(4 ℃条件下存放)。称取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制备得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液 精密称取桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素和白桦脂酸对照品适量,用甲醇制备成含8 种成分的混合对照品溶液,其母液质量浓度分别 为1.558、1.605、0.320、0.282、0.422、1.742、0.445、2.250 mg/mL,溶液经0.22 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液即得。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～40 min,5%～15% A；40～50 min,15%～25% A；50～60 min,25%～30%A；60～65 min,30%～5%A；65～80 min,5%～5% A)；白桦脂酸为等度洗脱(0～30 min,82%A)；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；进样器温度4 ℃；进样量10 μL；检测波长194、202、238、320、368、210 nm。8 种混合对照品及杜仲皮、叶、雄花样品HPLC 色谱图,见图1～6。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取“2.1.3” 项下8 种混合对照品贮备液,用甲醇适当稀释成不同的质量浓度,在“2.2” 项条件下进样,以对照品质量浓度为横坐标(X),色谱峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表2,表明各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 桃叶珊瑚苷HPLC 色谱图（λ=194 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of aucubin （λ=194 nm）

图2 松脂醇二葡萄糖苷色谱图（λ=202 nm）Fig.2 HPLC chromatograms of pinoresinol diglucoside （λ=202 nm）

图3 各成分HPLC 色谱图（λ=238 nm）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents （λ=238 nm）

图4 绿原酸HPLC 色谱图（λ=320 nm）Fig.4 HPLC chromatograms of chlorogenic acid （λ=320 nm）

2.3.2 精密度试验 取“2.1.3” 项下8 种混合对照品贮备液,在“2.2” 项条件下连续进样6次,第2 天再连续进样6 次,分别记录峰面积,计算得桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、白桦脂酸的日内峰面积RSD 分别为2.07%、1.88%、0.70%、0.54%、1.67%、0.66%、0.98%、0.14%；日间峰面积RSD 分别为2.53%、1.31%、0.42%、0.44%、1.83%、0.49%、0.36%、1.59%,表明仪器日内、日间精密度均良好。

图5 槲皮素HPLC 色谱图（λ=368 nm）Fig.5 HPLC chromatograms of querctin （λ=368 nm）

图6 白桦脂酸HPLC 色谱图（λ=210 nm）Fig.6 HPLC chromatograms of betulinic acid （λ=210 nm）

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 稳定性试验 取“2.1.1” “2.1.2” 项下供试品溶液,在“2.2” 项条件下,分别于0、4、8、12、24、36 h 进样,记录峰面积,计算得桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、白桦脂酸RSD 分别 为 3.0%、0.38%、1.73%、2.74%、1.04%、1.11%、1.60%、2.89%,表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取同一批样品,分别按“2.1.1” “2.1.2” 项下方法制备7 种成分和白桦脂酸的供试品溶液6 份,在“2.2” 项条件下进样,记录峰面积,计算得桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、白桦脂酸含量RSD 分别为2.69%、1.18%、2.14%、1.39%、2.27%、0.90%、1.16%、2.38%,表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一批含量已知的样品,精密加入桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、白桦脂酸(质量浓度分别为1.122、1.933、0.274、0.449、2.623、0.504、0.414、1.134 mg/mL)的对照品溶液各0.27、0.3、0.31、0.34、0.33、0.36、0.28、0.25 mL；0.54、0.6、0.62、0.68、0.66、0.72、0.56、0.50 mL；0.81、0.9、0.93、1.02、0.99、1.08、0.84、0.75 mL,并使得加入样品的溶剂总体积为25 mL,分别按 “2.1.1”“2.1.2” 项下方法制备7 种成分和白桦脂酸的供试品溶液9 份,在“2.2” 项条件下测定,记录峰面积,分别计算8 种成分50%、100%、150%水平的平均加样回收率。结果,桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素和白桦脂酸平均加样回收率分别为100.90%、103.58%、100.75%、97.70%、104.33%、95.75%、95.02%、101.79%,RSD 分别为1.49%、0.35%、1.00%、1.37%、0.63%、0.28%、0.99%、1.96%。

2.4 样品含量测定 精密称定杜仲皮、叶、雄花各1.00 g,分别按“2.1.1” “2.1.2” 项下方法制备7 种成分和白桦脂酸的供试品溶液各6 份,在“2.2” 项色谱条件下测定,记录峰面积。表3、图7 表明,杜仲皮、叶、雄花中8 种成分的含量存在差异,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、白桦脂酸的含量由高到低次序为雄花＞叶＞皮,绿原酸含量高低次序为叶＞雄花＞皮,而京尼平在杜仲皮中含量最高,且松脂醇二葡萄糖苷只在皮中检出。

表3 各成分含量测定结果（n=3，mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=3，mg/g） ）

图7 杜仲皮、叶、雄花中8 种成分含量Fig.7 Contents of eight chemical constituents in the bark，leaves and male flowers of E.ulmoides

3 讨论

杜仲所含化学成分种类繁多,以单一成分评价杜仲的成分差异或作为质量控制标准有所欠缺。故本实验选择8 种指标成分,分别代表杜仲中黄酮、环烯醚萜、木脂素、苯丙素、三萜类5 种主要有效成分［7-8］。当所检成分极性差距大的情况下,采用同一方法对成分进行提取和检测,可能会导致较大的结果误差。本实验所检测8 种成分中,考虑到白桦脂酸极性与其他7 种成分相差较大,故参照2020 年版《中国药典》 及文献［15］,采取单因素考察,并进行多波长检测后采集光谱数据分析,后决定将白桦脂酸提取及洗脱方式区别于其他7 种成分,所得结果良好。

杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷和京尼平含量最高,而杜仲叶及雄花中未检测到松脂醇二葡萄糖苷,这主要因为木脂素类成分主要存在于植物的木部和树脂中,故《中国药典》 将松脂醇二葡萄糖苷作为杜仲皮的质量标准。杜仲雄花中环烯醚萜类成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷含量以及三萜类白桦脂酸含量均明显高于皮和叶,表明萜类可能是杜仲雄花的主要成分,可将雄花中的桃叶珊瑚苷和白桦脂酸作为评价其药材质量的指标成分。杜仲叶中苯丙素类成分绿原酸含量最高。虽然有研究认为杜仲黄酮是杜仲的主要有效成分,但本次检测中槲皮素在3 个药用部位含量都很少,提示如果要对杜仲黄酮作进一步研究,还应选择杜仲中其他黄酮类成分进行分析。

同一部位不同批检测结果显示,桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、白桦脂酸含量呈现出较大的离散度,其他成分则相对稳定。桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、白桦脂酸主要存在于杜仲雄花和叶中,除了药用部位本身造成的主要差异外,产地、采收时间等因素也会对成分含量造成影响,这与文献［16-18］ 报道一致。

4 结论

本研究建立的方法高效灵敏、操作简单,能够准确描述杜仲3 个药用部位中8 种成分的含量特征。杜仲皮松脂醇二葡萄糖苷、京尼平含量最高；杜仲叶绿原酸含量最高；杜仲雄花中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、白桦脂酸含量最高,其中桃叶珊瑚苷和白桦脂酸或可作为杜仲雄花质量控制的指标成分。以期本实验结果为杜仲资源的进一步开发和利用提供实验基础,且能更全面评价其药材质量,为后续杜仲药效物质基础研究提供参考。