范 兴，蔡沓栗，杨成梓，黄德福*

(1.福建医科大学孟超肝胆医院药学部，福建 福州 350025；2.中国人民解放军联勤部队第九〇〇医院药学科，福建 福州 350025；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

肝宝胶囊为福建医科大学孟超肝胆医院院内制剂,适用于脂肪肝及急、慢性肝炎之肝热积滞证,已使用二十年,临床疗效显著［1-2］,但目前对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD) 作用机制尚不明确。故本研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS 的代谢组学方法,对NAFLD 大鼠血清代谢物进行分析鉴定,筛选差异代谢物,分析其相关代谢通路,从内源性代谢角度探讨肝宝胶囊治疗NAFLD 可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠,体质量(180±20) g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,动物生产许可证号SCXK (沪) 2017-0005。

1.2 试剂与药物 肝宝胶囊(每粒0.34 g,批号190203,闽药制字Z04107020) 由福建医科大学孟超肝胆医院制剂室制备,取内容物适量,蒸馏水依次稀释至288、144、72 g/L；复方蛋氨酸胆碱片(每 片 0.45 g,批 号 20180402,国药准字H22024764) 购于通化东宝药业股份有限公司。高脂饲料(87.3%基础饲料+2% 胆固醇+10% 猪油+0.7%猪胆盐,批号20190501) 由上海帆泊生物科技有限公司定制。丙氨酸氨基转移酶(ALT) 试剂盒(批号20190408)、天冬氨酸氨基转移酶(AST) 试剂盒 (批 号20190407)、总胆固醇(TC) 试剂盒(批号20190301)、甘油三酯(TG)试剂盒(批号20190228)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 试剂盒(批号20190322)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 试剂盒(批号20190321) 均购于南京建成生物工程研究所。甲醇 (批号18095161)、乙腈 (批号197336)、甲酸 (批号1993715) 为色谱纯,均购于美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 仪器 Acquity TM ultra 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；Triple TOF 5600+质谱仪(美国AB SCIEX 公 司)；酶标仪 (美 国 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组及给药 适应性饲养1 周后,将62 只大鼠随机分为分成空白组10 只,给予基础饲料喂养,造模组52 只,给予高脂饲料,自由饮水,持续饲养8 周后,随机处死造模大鼠2 只,取出肝脏做病理切片,判断模型是否复制成功。造模成功后,按照随机数字表法将造模成功SD 大鼠随机分为5 组:模型组、复方蛋氨酸胆碱片阳性对照组(365 mg/kg)和肝宝胶囊 高、中、低剂量组 (1 440、720、360 mg/kg),未进行造模大鼠作为空白组,每组均10 只,剂量均按人与大鼠体表面积折算的等效剂量比值转换计算［3］,灌胃给药,1 次/d,空白组与模型组用等剂量的生理盐水灌胃,连续4 周。给药期间,空白组继续喂饲普通饲料,其余各组喂饲高脂饲料,至实验结束。

2.2 标本采集与处理 末次给药12 h 后,大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血至无抗凝剂的采血管中,静置2 h 后,3 000 r/min 离心10 min,收集上层血清,分装,严格按试剂盒说明操作,检测血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C,剩余血清置-80 ℃冻存,由杭州联川生物技术股份有限公司进行UPLC-Q-TOF/MS 数据测试及分析。大鼠取血后,解剖取肝脏,取肝左叶相同部位用10% 中性甲醛固定,采用常规石蜡包埋,制作组织切片,苏木精-伊红(HE) 染色,在光学显微镜下观察肝脏组织病理形态。

2.3 代谢组学数据采集

2.3.1 血清样本前处理 取置于-80 ℃的血清样本,在冰上解冻,取样本20 μL 加预冷的50%甲醇120μL,涡旋1 min,室温放置10 min,提取液在-20 ℃过夜,13 000 r/min 离心20 min 后,上清液转入96 孔板,进行分析。QC 样本通过取上述各组血清样本10 μL,混合,按样本处理方法制备,每3 个样本插入1 个QC 样本以检验实验过程的重复性与稳定性。

2.3.2 色谱条件 ACQUITY UPLC T3 柱(100 mm×

2.1 mm,1.8 μm,美国Waters 公司),柱温35 ℃,流动相:A 为0.1%甲酸水,B 为含0.1%甲酸的乙腈,进样量4 μL,流速0.4 mL/min。梯度洗脱条件:0～0.5 min,5%B；0.5～7 min,5%～100%B；7～8 min,100% B；8～8.1 min,100%～5% B；8.1～10 min,5%B。

2.3.3 质谱条件 UPLC-Triple-TOF 5600+液质联用仪:正、负离子两种模式,喷雾电压5 000 V 和-4 500 V；气帘气(CUR)30 psi(1 psi=0.133 kPa),雾化气(Gs1) 60 psi,辅助气(Gs2) 60 psi；离子源温度(TEM) 650 ℃；二级质谱数据采集模式IDA 模式；扫描范围m/z 60～1 200 Da；采集时间150 ms/spectrum,采集速率100 counts/s,总循环时间0.56 s。

2.3.4 数据分析 通过ProteoWizard 软件将质谱原始数据转换为mzXML 格式,利用XCMS 对数据进行峰对齐、峰提取、归一化等步骤操作后,导入到SIMCA 14.1 软件中进行多元统计学分析,包括主成分分析(PCA)、最小二乘法判别分析(PLSDA)、正交最小二乘法判别分析(OPLS-DA),再经Metlin、HMDB、KEGG、in-house 标准品、MetaboAnalyst 4.0 等数据库进行差异代谢物的比对鉴定及代谢通路分析,以进行非靶标代谢组学研究。通过SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析,数据以() 表示。

3 结果

3.1 肝宝胶囊对NAFLD 大鼠的作用

3.1.1 生化指标 表1 显示,与空白组比较,模型组ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平升高(P＜0.01),HDL-C 水平下降(P＜0.01)；与模型组比较,各药物治疗组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平升高 (P＜0.01),HDL-C 水平降低(P＜0.01)。肝宝胶囊治疗后,各组肝功能与血脂得到不同程度的恢复,并随剂量增加更明显；与阳性对照组比较,肝宝胶囊低剂量组各指标无明显差异(P＞0.05),肝宝胶囊中剂量组ALT、LDL-C 水平低于阳性组,但差异无统计学意义(P＞0.05),其余指标差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)；高剂量组ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平低于阳性组(P＜0.01),HDL-C 水平更高(P＜0.01)。

表1 各组大鼠生化指标比较（， n=10）Tab.1 Comparison of biochemical indices in rats among various groups （， n=10）

表1 各组大鼠生化指标比较（， n=10）Tab.1 Comparison of biochemical indices in rats among various groups （， n=10）

注:与空白组比较,**P＜0.01；与模型组比较,＃＃P＜0.01；与阳性对照组比较,▲▲P＜0.01。

3.1.2 肝脏组织病理学变化 图1 显示,空白组大鼠肝组织结构清晰,肝细胞无脂肪变性,肝细胞大小均一,排列均匀,肝小叶结构正常,肝细胞索整齐排列；模型组大鼠肝细胞体积增大、肿胀,可见肝细胞脂肪变性明显,出现许多大小不等的空泡,细胞核挤向一侧,炎性细胞浸润；给药组均能不同程度改善肝脏组织脂肪病变,并随着给药剂量增加效果更明显,其中肝宝胶囊高剂量组基本接近空白组形态；阳性对照组改善作用强于肝宝胶囊低剂量组,但弱于肝宝胶囊中剂量组。

3.2 肝宝胶囊代谢组学研究

3.2.1 血清代谢轮廓分析 空白组、模型组、肝宝胶囊高剂量组大鼠血清在正、负离子模式下的总离子流图见图2,可知各组轮廓大致相似,但代谢物含量有差异。

图1 各组大鼠肝组织病理变化（HE，×400）Fig.1 Pathological changes of liver tissues of rats among various groups （HE，×400）

图2 空白组（A，B）、模型组（C，D） 和肝宝胶囊组（E，F） 大鼠血清总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of rat serum for normal group （A，B），model group （C，D），and Ganbao Capsules group （E，F）

3.2.2 多元统计分析 对各组样本数据进行PCA分析,发现QC 样本聚集度高,说明实验建立的方法重复性和稳定性较好,见图3A、3B。在正、负离子模式下,R2X 均值大于0.4,表明模型可靠,各组间聚集趋势良好。对各组样本进一步采用PLS-DA 分析,发现各组之间明显分离,其中空白组、模型组分别聚集在左右两侧,代谢图谱存在明显的差异,表明模型复制成功。肝宝胶囊组与模型组明显分开,并趋近于空白组,与生化指标、病理学改变结果一致,见图3C、3D。对数据模型进行置换检验(n=200) 验证,发现R2、Q2值均小于右端,前者在后者之上,并且后者回归直线与纵轴截距为负值,表明模型有效可靠,未产生过拟合现象,见图3E、3F。

3.2.3 差异代谢物筛选 图4A、4B 显示,空白组与模型组可被显著分开,表明模型具有较好解释与预测能力 (正离子模式R2X=0.610,R2Y=0.998,Q2=0.974；负离子模式R2X=0.516,R2Y=0.999,Q2=0.981)。模型组与肝宝胶囊组比较,结果见图4C、4D (正离子模式R2X=0.493,R2Y=0.991,Q2=0.994；负离子模式R2X=0.574,R2Y=0.993,Q2=0.959),可知OPLS-DA模型稳定可靠。对应的S-plot 图见图4E～4H,结合VIP 值＞1、t检验P＜0.05,并以变异倍数FC＞2或＜0.5 为标准,确定潜在差异代谢物。同时,通过一、二级质谱信息,并结合Metlin、HMDB、KEGG、in-house 标准品数据库查询和相关文献报道进行结构鉴定,最终筛选鉴定出26 个共有差异代谢物,见表2。

图3 各组样本的PCA （A，B）、PLS-DA （C，D） 得分图和模型验证（E，F）Fig.3 PCA （A，B），PLS-DA （C，D） score plots and permutation test （E，F） in various groups

3.2.4 差异代谢物的生物信息学分析 在HMDB数据库中查询26 个差异代谢物的细胞位置与生物学功能,发现主要存在于细胞外基质、细胞膜、细胞质及内质网；生物学功能主要作为膜稳定剂、能源存储、能量源、营养物及信号分子,提示肝宝胶囊在治疗NAFLD 过程中可能的机理及作用方向,见图5。

3.2.5 代谢通路分析 将筛选出的26 种差异代谢物导入MetaboAnalyst 4.0 软件进行代谢通路分析,发现涉及相关代谢通路15 条,以P＜0.01、Impact＞0.10 为标准,筛选出3 条与肝宝胶囊治疗NAFLD作用相关的最主要代谢途径,即甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢,其中影响最显著是鞘脂代谢,影响值最大的是花生四烯酸代谢,见图6。

4 讨论

本研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS 代谢组学方法探讨肝宝胶囊对NAFLD 大鼠的干预作用机制,共寻找出26 个潜在差异代谢物,涉及3 条代谢通路,现主要从代谢途径进行展开讨论。

4.1 甘油磷脂代谢 筛选出的差异代谢物主要为磷脂类 (磷脂酰胆碱PC、溶血磷脂酰胆碱LysoPCs 与溶血磷脂酰乙醇胺LysoPEs),涉及了甘油磷脂代谢通路；与空白组比较,模型组中PC 含量均相对减少,大多数LysoPCs、LysoPEs 均出现上升,而经给药干预后回调接近正常水平；可能由于PC、PE 在磷脂酶A 作用下过量水解生成LysoPCs、LysoPEs［4］,以致PC 含量不足,合成的脂蛋白减少,不能有效地使肝内脂肪运输到肝外,导致脂肪在肝脏中沉积,同时溶血磷脂酰胆碱是氧化型低密度脂蛋白的主要成分,可诱发炎症反应［5-6］,溶血卵磷脂类物质含量过高,对细胞膜有毒性作用［7-8］,从而对细胞膜系统造成损伤,最终导致脂质代谢紊乱,表明肝宝胶囊可能通过调节甘油磷脂代谢通路,从而改善NAFLD。

图4 各组OPLS-DA 得分图Fig.4 OPLS-DA score plots in various groups

图5 差异代谢物分类Fig.5 Classification of differential metabolites

表2 各组大鼠血清差异代谢物Tab.2 Differential serum metabolites in rats in various groups

图6 差异代谢物MetPA 通路分析Fig.6 MetPA analysis of differential metabolites

4.2 鞘脂代谢 鞘脂是一类以鞘氨醇为骨架的复杂化合物,在细胞代谢、生长、信号转导、死亡等多种生物学功能中发挥重要作用。鞘氨醇、二氢鞘氨醇分别在神经酰胺合成酶、脂肪酰转移酶作用下形成神经酰胺,神经酰胺作为细胞凋亡信号调控的第二信使因子,参与了NAFLD 大鼠肝细胞内的脂质沉积过程［9-12］。在实验中,模型组中大鼠血清的鞘脂类鞘氨醇、二氢鞘氨醇显著升高,经肝宝胶囊给药干预后回调并趋于正常水平,可能是通过调节鞘脂代谢而起作用［13-14］。

4.3 花生四烯酸代谢 花生四烯酸一般不游离存在,而是以磷脂的形式酯化在细胞膜中,与空白组相比,模型组中花生四烯酸含量显著上升,可能由于多种刺激因子激活磷脂酶A2,从而使花生四烯酸从膜磷脂中游离出来,诱发的炎症反应也可使细胞膜遭到破坏,同时花生四烯酸的代谢产物LXA4(脂氧素) 可激活AHR (芳香烃受体) 增加其靶基因CD36 的表达,增加肝细胞脂肪酸摄取和肝脏脂质沉积［15-19］,经肝宝胶囊给药后,花生四烯酸有所回调,可能通过调节花生四烯酸的代谢,抑制炎症介质的产生,起到减轻肝细胞的炎症反应作用。

综上所述,肝宝胶囊对NAFLD 大鼠改善作用明显,通过药效作用、差异代谢物及代谢通路生物学意义分析,推测可能主要通过调节甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢等多成分多通路而发挥作用,从而为临床上肝宝胶囊治疗NAFLD 进一步奠定实验基础。