王玉林，邵晓玮，王建强，曹洪杰，张士财

(滨州市食品药品检验检测中心，山东 滨州 256600）

万氏牛黄清心丸收载于2020 年版《中国药典》 一部,是由牛黄、朱砂、黄连、栀子、郁金、黄芩6 味药材组成的中药制剂,临床上用于清热解毒、镇惊安神［1］,但其现行标准只规定了朱砂、黄连中盐酸小檗碱含量的测定方法,黄芩苷、栀子苷等有效成分只有TLC 定性鉴别,尚无牛黄、黄芩、栀子所含有效成分,文献［2-5］ 也只涉及含量较高的盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷。

为了更全面地评价万氏牛黄清心丸质量,本实验采用HPLC 法同时测定该制剂中栀子苷、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、胆红素的含量,对比药典法,该方法更简便、易于操作,可为今后其质量标准的完善提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AD 高效液相色谱仪,配置SPD-20A 检测器(日本岛津公司)；XS205DU 电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-300VDV 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 万氏牛黄清心丸［每丸1.5 g,国药集团冯了性 (佛山) 药业有限公司,批号180013］。栀子苷 (纯度97.6%,批号110749-201718)、黄芩苷 (纯度95.4%,批号110715-201821)、盐酸巴马 汀 (纯 度 86.8%,批 号110732-201611)、盐酸黄连碱(纯度95.1%,批号112026-201601)、盐酸小檗碱(纯度86.7%,批号110713-201212)、胆红素 (纯 度98.9%,批 号100077-201808) 对照品(中国食品药品检定研究院)；表小檗碱对照品 (纯度98.59%,批号B-064-180818) (成都瑞芬思科技有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司)；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 InertSustain C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相乙腈(A) -0.05 mol/L磷酸二氢钾(B),梯度洗脱(0～15 min,10%～20%A；15～40 min,20% A；40～60 min,20%～40% A；60～80 min,40%～10% A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210、345 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取各对照品适量,置于量瓶中,甲醇溶解定容至刻度 (胆红素用氯仿溶解),即得 (各成分质量浓度分别为栀子苷1.988 1 mg/mL、黄芩苷4.928 4 mg/mL、表小檗碱1.024 8 mg/mL、盐酸黄连碱1.518 7 mg/mL、盐酸巴马汀 1.554 6 mg/mL、盐酸小檗 碱2.044 4 mg/mL、胆红素5.076 5 mg/mL)。

2.2.2 供试品溶液 精密称取丸剂适量,研细,混匀,取约1.00 g,精密称定,加入40 mL 10%氯仿-乙醇,称定质量,超声(200 W、45 kHz) 处理30 min,放冷,10%氯仿-乙醇补足减失的质量,上清液经0.2 μm 微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方及制剂工艺,分别制备缺栀子、缺黄芩、缺黄连、缺牛黄的阴性样品,按“2.2.2” 项下方法制备,既得。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,供试品在各成分对照品相应位置上均有相同保留时间的色谱峰,阴性无干扰,表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.1” 项下贮备液,甲醇或氯仿稀释成不同质量浓度,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X),峰面积纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密量取“2.4” 项下稀释的对照品溶液,取中间质量浓度,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得栀子苷、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、胆红素峰面积RSD 分别为0.10%、0.18%、0.09%、0.21%、0.15%、0.11%、0.20%,表明仪器精密度良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 稳定性试验 取丸剂适量(批号180013),按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,于0、4、8、16、32、48 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得栀子苷、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、胆红素峰面积RSD分别为0.56%、0.69%、0.88%、0.58%、0.97%、0.48%、0.62%,表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取丸剂适量(批号180013),按“2.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得栀子苷、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、胆红素峰面积RSD 分别为0.83%、0.63%、1.03%、1.10%、0.88%、0.78%、1.21%,保留时间RSD 分别为0.42%、0.22%、0.58%、0.61%、0.38%、0.24%、0.15%,表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的丸剂6 份(批号180013),每份约0.5 g,精密加入“2.2.1” 项下栀子苷贮备液1.78 mL、黄芩苷贮备液1.45 mL、表小檗碱贮备液0.57 mL、盐酸黄连碱贮备液1.24 mL、盐酸巴马汀贮备液1.48 mL、盐酸小檗碱贮备液2.77 mL、胆红素贮备液0.80 mL,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,栀子苷、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、胆红素平均加样回收率分别为98.32%、99.69%、97.25%、99.10%、98.21%、98.94%、99.10%,RSD 分别为1.57%、1.20%、1.63%、0.95%、1.14%、0.85%、0.93%。

2.9 样品含量测定 取丸剂3 批,每批3 份,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含量,结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg/g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g， n=3）

3 讨论

3.1 评价指标选择 在2020 年版《中国药典》一部中［1］,只对朱砂、盐酸小檗碱进行了含量控制。胆红素、黄芩苷、栀子苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀作为万氏牛黄清心丸中牛黄、黄芩、栀子、黄连的有效成分,对制剂功能和主治发挥了重要作用,但现行标准中并未对其含量进行测定,难以全面反映质量。因此,本实验选择上述7种成分作为评价指标。

3.2 检测波长选择 结合2020 年版《中国药典》及文献［1-18］ 发现,盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、表小檗碱在345 nm 波长处有最大吸收,再比较了栀子苷、黄芩苷、胆红素在248、280、453、210 nm 波长处的吸收,结果选择210 nm。最终,采用345、210 nm 检测波长,可保证各成分均有最大吸收,提高了灵敏度,并使定量更准确。

3.3 流动相选择 本实验比较了乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1% 磷 酸、乙 腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾［2-18］,发现乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾梯度洗脱时基线平稳,各成分色谱峰分离度、理论塔板数良好,阴性无干扰。

3.4 色谱柱选择 本实验比较了phenomenex Luna C18、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、InertSustain C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),发现各色谱柱分离效果均良好,表明该方法稳定耐用。

3.5 提取方法选择 根据万氏牛黄清心丸的制备工艺和所测成分的溶解性,本实验采用70%甲醇、甲醇、70%氯仿乙醇、10%氯仿乙醇进行超声、回流提取,最终选择10%氯仿乙醇超声提取30 min,此时各成分能被同时提取。