沈 涟 华沛旻* 李海波

1.江苏省无锡市妇幼保健院(214000)；2.江苏省南通市妇幼保健院

21三体综合征是常见染色体非整倍出生缺陷类疾病，给家庭造成经济和精神压力，也给社会带来一定负担[1-2]。产前筛查诊断并采取措施及时终止妊娠，是目前降低其发生的唯一方法。羊水细胞染色体核检验为当前临床诊断21三体综合征的金标准，然而羊水穿刺难以被孕妇普遍接受[3-4]。母体血清学检测是21三体综合征产前筛查重要方法之一，但检出率仅66.7%[5]。近年有研究发现母体外周血浆中有游离胎儿mRNA，对染色体异常胎儿的检出有一定价值[6]。本研究回顾性分析产前筛查孕妇临床资料，探讨母体血清学及血中胎儿游离mRNA检测在21三体综合征产前筛查价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2016年4月—2017年10月于本院产前筛查并确诊胎儿为21三体综合征的单胎孕妇30例(综合征组)和胎儿正常的单胎孕妇60例(健康组)临床资料，年龄25～41岁，孕周15～20+6周。孕妇产前均行母体血清学、母体血胎儿游离mRNA和外周血胎儿游离DNA无创(NIPT)检测。本研究经本院伦理委员会审批。孕妇均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1母体血清学抽取孕妇外周静脉血离心分离血清，-20℃保存。采用荧光免疫分析检测其血清甲胎蛋白(AFP)、绒毛膜促性腺激素(HCG)、游离雌三醇(uE3)水平，结合孕妇年龄、孕周、体重指标采用T1-risk风险统计软件计算21三体综合征发生风险，以1:270作为高风险切割值。

1.2.2母体血游离胎儿mRNA①标本处理：抽取孕妇外周静脉血抗凝4℃离心取血清-20℃保存；血浆标本4℃离心取上清液至灭菌Eppendorf管中，-80℃保存。②人血浆总RNA抽取：每1.6ml血浆中加入TRIZOL试剂2ml，震荡混匀，室温下静置5min后加入氯仿400μl，混匀，4℃离心15min，静置取上清液，加入等体积异丙醇及冰乙酸200μl，-20℃静置30min，4℃离心20min，除去上清液，70%乙醇重悬，4℃离心5min，除去残液，37℃晾干，加入35μl双蒸水溶解沉淀，-80℃保存。③总RNA反转录：反应体系总体积为20μl，见表1，反应条件为30°C 60min，42°C 5min，99℃ 5min，所获产物-20℃保存。④参照相关文献设计合成引物，见表2。⑤QF-PCR：反应体系总体积为20μl，见表3，反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环。

表1 总RNA反转录体系

表2 引物序列

表3 QF-PCR反应体系

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组孕妇血清学指标比较

综合征组血清AFP Mom、uE3 Mom低于健康组，HCG Mom高于健康组(P<0.05)。见表4。

表4 两组孕妇血清学指标比较

2.2 两组孕妇基因检出率比较

两组孕妇外周血均检测出HPL、β-hCG、TFPI2、PLAC4基因，两组基因检出率(100.0%、100.0%)无差异(P>0.05)。

2.3 两组孕妇血浆基因mRNA表达量比较

孕妇血浆中，综合征组HPL、β-hCG、PLAC4基因mRNA表达量均大于健康组(P<0.05)，TFPI2基因mRNA表达量与健康组无差异(P>0.05)。见表5。

表5 两组孕妇血浆基因mRNA表达量比较

2.4 孕妇血清学、孕妇血胎儿游离mRNA和NIPT筛查21三体综合征效能

孕妇血胎儿游离mRNA检测与NIPT筛查21三体综合征的AUC值无差异(Z=0.888，P>0.05)但均大于血清学检测(Z=2.964、3.287，均P<0.05)。见表6。

表6 不同方法筛查21三体综合征 效能

3 讨论

21三体综合征是染色体异常导致的一种先天性病变，发生率达出生人口的1/600[7-8]。产前筛查、诊断21三体综合征为优生关注内容。由于羊水穿刺有创操作，可能会影响孕妇及胎儿健康，不适用于广泛筛查；而通过产前筛查确定高危人群，再采用羊水细胞染色体核检验明确诊断，是当前21三体综合征产前诊断的主要方法。

母体血清学检测是目前临床对孕妇产前筛查的一种检测方法，检测指标包括AFP、HCG、uE3等，因单项指标检测效能不高需行多个指标联合检测[9]。本院孕妇孕中期主要行血清AFP、HCG、uE3三联检查。本次结果显示，21三体综合征组血清AFP Mom、uE3 Mom值均低于健康组，HCG Mom值高于健康组，提示孕妇血清AFP、Free-β-hCG、uE3水平与21三体综合征有一定关系。尽管母体血清学检测在21三体综合征产前筛查中应用较广，当假阳性率为5%～9%时检出率为85%～90%，但仍缺乏诊断力，同时也存在敏感度低、假阳性率较高等问题[10]。本研究母体血清学筛查21三体综合征的敏感度和特异度分别为66.7%和80.0%，可见母体血清学检测检出21三体综合征的效能并不高。

探寻新的无创产前染色体疾病筛查方法是众多医学者研究重点，孕妇外周血胎儿游离DNA的发现在无创产前染色体疾病筛查中具有重要意义。众多研究分析了母血游离胎儿DNA在染色体疾病中的诊断价值，而RNA作为遗传信息载体，在临床产前筛查染色体病变中的研究相对较少。过去认为人体血液中含有RNA酶，因此机体血浆和血清中不存在游离RNA；但是随着大量研究发现，孕妇血浆和血清中存在胎儿游离RNA，且稳定性较好[11-12]。有研究对子痫前期孕妇和正常孕妇血浆检测发现，前者血浆游离mRNA含量显著高于后者，认为孕妇血浆游离mRNA水平可以评估和监测部分病理妊娠[13]。PLAC4基因来源于21号染色体，本次研究分析显示两组孕妇外周血均检测出HPL、β-hCG、TFPI2和PLAC4基因，且HPL、β-hCG、PLAC4基因mRNA表达量21三体综合征组均大于健康组，与程蔚蔚等[14]研究结果相符，提示此基因有望成为21三体综合征胎儿产前筛查的重要标志物。本研究检测筛查效能显示，母体血胎儿游离mRNA检测筛查21三体综合征的AUC值大于母体血清学检测，敏感度和特异度80.0%以上，但与NIPT AUC值无差异，提示母体血胎儿游离mRNA检测对21三体综合征的诊断效能较高且与NIPT接近。

综上所述，母体血清学检测和血胎儿游离mRNA检测在21三体综合征产前筛查中均有重要价值且后者效能更高。但由于胎儿游离mRNA检测更复杂、费用相对较高，在临床中目前尚未推广使用，期待随着检测技术的提高可能成为一项产前筛查的常用方法。