(青岛大学附属医院消化内科，山东 青岛 266003)

胃癌(GC)是全球五大常见恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的三大原因之一[1]。每年中国GC新发病例数达70万，新增死亡病例数约50万，平均每天有1 300多例GC患者死亡[2]。尽管目前GC的诊断和治疗均取得了显著成效，但大多数患者被发现时已是晚期或已发生转移，GC患者的5年生存率仍不足10%[3]。因此，探索GC诊断和预后的精准生物标志物十分必要。

Ⅴ型胶原蛋白α2(COL5A2)属于Ⅴ型胶原蛋白家族的一个亚型，是一种具有调节作用的纤维胶原，在原纤维的形成和肿瘤浸润转移的过程中起重要作用[4-6]。胶原蛋白超家族由28种不同类型的胶原组成，是细胞外基质的主要组成部分，占人体总蛋白的30%，对维持细胞正常的内稳态至关重要[7]。而细胞外基质是肿瘤微环境发生的关键，故近年来各类胶原蛋白在肿瘤中的作用受到了广泛关注。研究显示，COL5A2基因与膀胱癌、食管癌、结直肠癌以及胰管腺癌等的发生发展具有密切的关系[8-11]。WANG[12]利用芯片数据和网络插件筛选与GC相关的差异表达基因，鉴定出COL5A2基因是GC中的一个关键基因。之后，WEI等[13]通过加权相关网络和机器学习方法发现COL5A2基因是GC的不良预后因素。但上述相关研究只停留在基因网络宏观层面，没有具体明确COL5A2基因在GC组织或细胞中的表达水平、突变情况以及可能参与的生物学过程。本研究通过对肿瘤芯片数据库的挖掘和体外GC细胞功能实验的研究，全面分析COL5A2基因在GC组织中的表达及其与患者预后的关系，探讨COL5A2基因在GC中可能发挥的功能，并评估其作为GC诊断和预后生物标志物的潜力。

1 材料和方法

1.1 利用Oncomine数据库分析COL5A2基因表达水平

登录Oncomine数据库(https://www.onco-mine.org/)[14]检索COL5A2基因在不同肿瘤类型中的表达。数据设置的筛选条件如下:①基因为COL5A2；②数据比较类型为肿瘤组织与正常组织；③临界值设定范围为P<0.000 1,差异表达级别>2,基因排序为前10%。在以上条件的基础上检索COL5A2基因在GC中的表达，限定条件为：①肿瘤类型为GC；②数据类型为mRNA；③样本类型为临床标本。

1.2 利用cBioPortal数据库分析GC中COL5A2基因的突变情况

在cBioPortal数据库(https://www.cbioportal.org/)[15]当中，选择“Stomach Adenocarcinoma(TCGA, Firehose Legancy)”数据集,选择“带有mRNA数据(RNA Seq V2)”的病例集，输入基因名“COL5A2”，分析其在GC中的突变情况。在此基础上点击“Comparison/Survival”按钮，在Survival板块中生成COL5A2基因突变组与非突变组的生存曲线图。

1.3 用Kaplan-Meier Plotter数据库对COL5A2基因与GC患者预后的相关性进行分析

进入Kaplan-Meier Plotter平台(https://kmplot.com/analysis/)[16]，在肿瘤类型中选择“Gastric cancer”进行分析，生存条件限定为“overall survi-val”，检索获得COL5A2 mRNA与GC患者预后相关的生存曲线图。

1.4 利用GEPIA数据库验证COL5A2 mRNA的表达及与患者预后关系

登录GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)[17],点击“Expression DIY”按钮，进入“Boxplot”页面，检索COL5A2基因在GC组织中的表达水平，设置检索条件为：①|log2FC|≥1,P<0.01；②正常数据的匹配为Match TCGA normal and GTEx data。此外，选择“Stage plot”页面，默认原始参数，检索COL5A2基因在不同GC分期中的表达情况。而在“Survival Plots”页面中，设置组内截断值为“Median”，输入肿瘤名称“Stomach adenocarcinoma (STAD)”和基因名称“COL5A2”，获取患者生存曲线图。

1.5 利用GeneMANIA数据库绘制COL5A2基因互作网络图

在GeneMANIA数据库(https://genemania.org/)[18]官网首页中，输入基因“COL5A2”，构建其相关基因网络树状图。之后通过Metascape在线网络工具(http://metascape.org/gp/index.html)[19]，将COL5A2及其相关联基因输入，进行功能富集分析，限定条件为:①输入物种为Any species；②分析物种为H. sapiens(20)。

1.6 细胞培养及GC细胞COL5A2 mRNA表达水平的检测

正常人胃上皮细胞株GES-1以及GC细胞株HGC-27、MKN-45购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司，GC细胞株BGC-823和SGC-7901获赠自青岛大学病原微生物研究中心。所有细胞均培养于含体积分数0.10胎牛血清及1%青链霉素混合液的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的湿化培养箱中常规培养。

采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测COL5A2 mRNA的表达水平。先利用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，以总RNA为模板使用反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将RNA逆转录为cDNA，之后按照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司)的说明书步骤配制相应体系来进行PCR扩增。所涉及的引物序列见表1。以GAPDH基因为内参对照，以2-△△CT测定目的基因mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR检测COL5A2 mRNA表达水平所用引物序列

1.7 siRNA对HGC-27细胞的转染以及转染率的测定

将处于对数生长期的HGC-27细胞以同等密度接种于6孔板上，待孔内细胞融合为60%～70%时，使用Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)进行转染，使COL5A2基因在细胞中低表达。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，具体序列见表2。将细胞分为阴性对照组(si-NC组)、转染COL5A2-homo-4038 siRNA组(si-1转染组)、转染COL5A2-homo-3838 siRNA组(si-2转染组)和转染COL5A2-homo-4506 siRNA组(si-3转染组)。siRNA和Lipofectamine 3000按1∶1比例加入完全培养基中，培养48 h后通过qRT-PCR 方法(检测方法同1.6) 检测各组细胞的COL5A2 mRNA的表达情况。

表2 细胞转染所涉及的siRNA序列

1.8 CCK-8实验检测GC细胞的增殖能力

将处于对数生长期的HGC-27细胞制成单细胞悬液，按照2 000个/孔细胞密度接种于96孔板中并进行转染。分别于转染培养后0、24、48、72 h于每孔加入CCK-8试剂(上海碧云天生物技术有限公司)10 μL，置于恒温细胞培养箱内孵育1.5 h，以酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度(A)值。

1.9 克隆形成实验检测GC细胞克隆形成能力

收集转染48 h的HGC-27细胞制备成单细胞悬液，以1 000个/孔的细胞密度接种于6孔板中。置于恒温培养箱中培养，每4～5 d更换完全培养基，待2周形成细胞克隆后终止培养。使用多聚甲醛溶液固定细胞30 min以后，用结晶紫溶液染色15 min，用PBS洗涤2～3次，晾干后计算细胞克隆数量。

1.10 统计学方法

2 结 果

2.1 GC组织样本中COL5A2基因的表达情况

利用Oncomine数据库在线分析COL5A2基因在多种类型肿瘤组织中的表达情况，结果显示，涉及COL5A2基因的研究共417项，78项有统计学差异，在肿瘤组织中高表达75项，低表达3项。其中在GC中高表达的数据集有7项，包括5项mR-NA和2项DNA数据集。选择Cui Gastric、Wang Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 5个mRNA数据集来确定COL5A2基因在GC中的表达情况,共涉及组织样本478例。将数据集进行荟萃分析显示，COL5A2 mRNA在GC差异表达基因的中位秩为105.00，P值为4.05×10-7，显示COL5A2 mRNA在GC组织中呈高表达。以箱式图对上述5项研究进行分析，结果显示COL5A2基因在GC组织中的表达均明显高于正常胃黏膜组织。见图1。

2.2 COL5A2基因在GC组织的变异情况

在cBioPortal数据库中一共访问了415例GC样本信息，其中43例发生COL5A2基因变异(突变率为10.36%)，包括扩增6例，深度缺失5例，截断突变5例，错义突变11例，信使RNA水平上调7例，信使RNA水平下调9例。比较COL5A2基因突变样本与非突变样本的生存差异，显示COL5A2基因突变样本患者比非突变样本患者的总生存期(OS)更长。其中COL5A2基因突变组和非突变组的中位OS分别为57.39、26.45个月。见图2A。

2.3 COL5A2基因与GC患者临床预后的相关性

对Kaplan-Meier生存曲线分析显示，COL5A2 mRNA高表达的患者的OS明显短于低表达的患者(HR=1.35，P<0.05)。其中COL5A2 mRNA高表达和低表达的中位OS分别为26.70、44.07个月。见图2B。

2.4 COL5A2基因在GC组织中的表达及其与患者预后的关系

在GEPIA数据库中对COL5A2基因在GC组织中的表达及其与GC患者预后的关系进行验证，结果显示，基于TCGA 和GTEx 数据集，COL5A2 mRNA在408例GC组织中的表达明显高于211例正常胃黏膜组织；同时还发现COL5A2 mRNA表达水平与GC患者的分期有显著关系，Ⅰ期胃癌患者COL5A2 mRNA表达水平比Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期GC患者表达低(F=2.65，P<0.05)。此外，GEPIA在线生存分析显示，GC患者COL5A2 基因表达水平与OS有关(HR=1.5，P<0.05)。见图2C。

2.5 COL5A2的关联基因及其相关功能的预测

为了进一步研究COL5A2基因可能参与的生物学通路和功能，本研究利用GeneMANIA数据库对COL5A2参与的基因互作调控网络进行分析，结果以COL5A2基因为中心，呈扇形与多种基因互作展开，基因节点的大小表明了相互作用的强度，与COL5A2相互作用的基因互作的强度由强到弱分别包括COL5A1、BMP1、ITGA1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、COL6A3、TGM2、POSTN、SPARC、FN1、FBXW11、GP6、COL11A1、COL4A2、LAMC1、LUM、THBS2、MXRA5、FAP。见图3。随后对其进行功能富集预测，结果显示相关基因主要与整合素通路、细胞外基质受体交互、细胞基质黏附、骨骼系统开发、肽交联、血管形态发生、细胞外基质分解及组织成形等有关。

图1 Oncomine数据库5个GC芯片的COL5A2基因表达柱状图

A：cBioPortal数据库生存差异分析图，B：Kaplan-Meier Plotter数据库生存曲线图，C：GEPIA数据库生存曲线图

图3 GeneMANIA数据库基因互作网络图

2.6 GC细胞系中COL5A2 mRNA的表达情况

qRT-PCR结果显示，GES-1、HGC-27、MKN-45、BGC-823和SGC-7901中COL5A2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、419.00±2.08、228.00±1.53、2.67±0.32、3.87±0.19，4种GC细胞株HGC-27、MKN-45、BGC-823和SGC-7901COL5A2 mRNA的表达水平均高于GES-1，差异具有统计学意义(F=253.40，P<0.05)，且在MKN-45和HGC-27细胞株中COL5A2 mRNA的表达量更高。因此，进行后续细胞功能实验，可选用HGC-27或者MKN-45细胞株。

2.7 COL5A2 siRNA的转染效率

将COL5A2 siRNA转染HGC-27细胞，培养48 h后采用qRT-PCR技术检测COL5A2基因干扰率。结果显示，在HGC-27细胞中，si-1、si-2和si-3转染组中COL5A2 mRNA的表达水平分别为0.23±0.04、0.38±0.05、0.82±0.04，明显低于si-NC组(1.00±0.00)的表达水平，差异具有显著性(F=93.06，P<0.05)，但si-1和si-2干扰效果更为显著，因此，后续选用si-1和si-2进行细胞功能实验。

2.8 下调COL5A2基因后HGC-27细胞的增殖活力情况

CCK-8实验结果显示，时间、分组以及时间与分组交互作用对HGC-27细胞增殖活力均有显著的影响(F=4.50～223.60，P<0.05)。3组细胞转染48、72 h时的增殖活力与转染0、24 h比具有明显差异(F=38.90～70.30，q=8.18～25.21，P<0.05)。而与相应的si-NC组比较，转染72 h时，si-1和si-2组细胞增殖活力明显降低，差异有统计学意义(F=21.29，q=8.58、9.87，P<0.05)；转染0、24、48 h时，si-1和si-2组细胞增殖活力与相应的si-NC组比较无显著差异。见表3。此外，细胞克隆实验检测结果显示，si-1、si-2和si-NC组形成的克隆数量分别为61.33±6.89、72.33±8.35、114.00±9.54，si-1和si-2组形成的克隆数量明显少于si-NC组，差异有统计学意义(F=11.12，P<0.05)。见图4。

表3 不同转染时间对HGC-27细胞增殖活力的影响

A：si-NC组，B：si-1转染组，C：si-2转染组

3 讨 论

GC是一种发病率高、治疗手段有限、临床疗效差的恶性肿瘤，开发新的生物标志物来预测GC患者的临床预后非常重要。细胞外基质处于一种动态平衡状态，通过调节纤维蛋白和各种胶原沉积而不断重构，调控肿瘤形成过程中的各种细胞行为[20]。已被证实多种胶原蛋白与人类多种肿瘤的发生与发展密切相关，如Ⅴ型胶原蛋白家族成员COL5A2。COL5A2是细胞外基质中一个重要组成部分，与Ⅰ型胶原形成异型纤维，从而在肿瘤浸润转移的初始过程中发挥重要作用[4-5,21]。然而，目前比较缺乏COL5A2基因在GC中具体表达和作用的相关研究。因此，本研究基于数据库挖掘探讨COL5A2基因在GC中的作用，为后续预后生物标志物的筛选、靶向药物的开发等提供一定的基础。

COL5A2基因与人类多种类型肿瘤的发生发展密切相关。WU等[22]利用生物信息学方法发现COL5A2基因在正常结肠组织中不表达，但在结直肠癌肿瘤组织中表达；同时PATRA等[23]报道了COL5A2 mRNA在结直肠癌组织中高表达；以上结果均提示COL5A2基因在结直肠癌发生发展中发挥促癌作用。另一方面，有研究发现NKX2-2基因在骨肉瘤中可通过介导COL5A2基因导致转录下调，从而起到抑制肿瘤的作用[24]。在对卵巢癌细胞(SKOV-3)和卵巢表面上皮细胞来源的外泌体蛋白质和脂质体分析中发现，SKOV-3来源的外泌体中COL5A2蛋白显著高表达，提示其在卵巢癌早期诊断中具有重要作用[25]。此外，COL5A2基因也可被视为肿瘤的生物标志物，与肿瘤患者的预后密不可分。ZENG等[26]研究报道COL5A2 mRNA在膀胱癌中高表达，与肿瘤侵袭性、T分期、N分期密切相关，并且COL5A2 mRNA高表达患者比低表达患者的临床结局更差、生存率更低。同样的，WENG等[27]研究发现COL5A2基因高表达的肺癌患者生存率低于低表达患者，认为COL5A2基因是肺癌患者的预后不良因素。值得注意的是，有研究发现在舌鳞状细胞癌患者中，COL5A2基因高表达患者比低表达患者的无病生存期更长，认为COL5A2基因是舌鳞状细胞癌预后有利因素[28]。因此，COL5A2基因在肿瘤中的作用是复杂的，在不同的癌症中发挥着不同的作用，对于COL5A2基因与特定肿瘤的关系，应当特定研究。

随着基因测序技术的发展，各种大规模的癌症基因组项目收集了多维度的癌症基因组学数据，这给癌症基因组数据的研究、分析和整合提供了丰富的资源。Oncomine是世界上最大的癌基因芯片在线数据库，包含全面癌症微阵列信息，有利于发现新型肿瘤生物标记物或治疗靶点[14]。cBioPortal是一个多维度分析癌症基因组学数据的网络资源，可视化呈现基因和癌症样本之间的遗传变化[15]。Kaplan-Meier Plotter是一个包含基因表达数据和临床数据的公共网络平台，可评估54 000个基因对包括GC在内的21种肿瘤预后的影响[16]。GEPIA数据库整合了TCGA和GTEx数据，提供肿瘤样本和正常样本的RNA测序数据，对肿瘤相关联的基因表达谱数据进行动态分析，从而深入挖掘新型肿瘤标记物[17]。

本研究基于对以上肿瘤芯片数据库的挖掘，分析COL5A2基因在GC中的表达及其与GC患者临床预后的关系。首先在Oncomine数据库中本研究结果显示COL5A2基因在GC组织中高表达；通过cBioPortal数据库检索到的415例GC样本信息，表明COL5A2基因突变组比非突变组患者OS更长；在Kaplan-Meier Plotter平台进行生存分析显示，高表达COL5A2 mRNA的GC患者比低表达者预后更差。同时，GEPIA数据库分析表明，COL5A2 mRNA不仅在GC组织中高表达，且还与GC患者的肿瘤分期相关。此外，GEPIA数据库的生存分析也支持前序结果，表明高COL5A2 mRNA表达与GC患者的不良临床预后显著相关，提示COL5A2基因是GC预后的不利因素。之后，本研究同时在分子水平上进行了验证，检测不同类型GC细胞系中COL5A2 mRNA的表达情况，发现COL5A2在HGC-27以及MKN-45胃癌细胞株中呈显著增高，与COL5A2 mRNA在GC组织中高表达的结果一致，因此，认为COL5A2基因在胃癌组织中发挥促癌基因的作用。

有关研究表明，COL5A2基因可能通过缺氧、凝血、根尖连接、血管生成和凋亡等途径促进肿瘤的进展[25]。此外，MENG等[29]研究发现COL5A2基因与上皮间质转化和细胞基质血管化高度相关，这些过程与癌症的侵袭以及转移均密切相关，推测COL5A2基因的表达可能与肿瘤侵袭密切相关。这在一定程度上解释了COL5A2基因对肿瘤发生预测的能力。GeneMANIA是一个包含基因互作和潜在功能的平台在线数据库，而Metascape是一个提供全面的基因列表资源和分析的高效工具，通过以上2种数据库，本研究评估了COL5A2密切关联的基因，从而进一步分析其可能参与的生物学途径与功能。首先，在分子水平上本研究发现COL5A2与COL5A1、MP1、ITGA1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、COL6A3、TGM2、POSTN、SPARC、FN1、FBXW11、GP6、COL11A1、COL4A2、LAMC1、LUM、THBS2、MXRA5、FAP等基因互作调控，功能富集发现主要与整合素通路、细胞外基质受体交互、细胞基质黏附、骨骼系统开发、肽交联、血管形态发生及组织成形等有关。在这基础上，本研究还验证了COL5A2基因对GC细胞增殖和克隆形成能力的确切作用。CCK-8和细胞克隆实验表明，在HGC-27细胞下调COL5A2 mRNA表达后，细胞的增殖能力和克隆形成能力均明显下降。本研究仍有尚未探索的方面，今后应进一步探寻COL5A2基因在GC中的关键信号通路和下游靶基因等。

综上所述，COL5A2基因在GC组织和GC细胞中高表达，且与GC患者的肿瘤分期和不良预后密切相关，COL5A2基因突变患者预后相对较好，且COL5A2基因与细胞外基质受体交互、骨骼系统开发、肽交联等有关，下调COL5A2基因的表达可抑制GC细胞的增殖和克隆形成能力。COL5A2基因在GC进展中起到重要作用，有望成为GC治疗的潜在新靶点。