母润红,聂丹丹,赵 明,马 丽

(1.北华大学基础医学院,吉林 吉林 132013；2.长春海关技术中心，吉林 长春 130000)

WHO将非洲猪瘟列为动物疫病[1]。我国是养猪大国，建立灵敏、准确的诊断方法尤为重要。金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌污染饲料和水源是导致病原传播的重要因素[1-2]。家禽家畜一旦感染此种致病菌可引起相应的传染病，并在畜禽中广泛传播，发病率和传染性均较强[2]。因此，迫切需要开发一种快速定量检测病原体的技术。而微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)检测技术是全新的技术手段[3-4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标准菌株15株，购自美国典型培养物保藏中心(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、猪霍乱沙门氏菌、李斯特菌、普通变形杆菌、小肠耶尔森菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、阴沟肠杆菌)和长春海关技术中心保存菌株中心(霍乱弧菌、志贺氏菌)。

2×dd PCR预混液和PCR耗材购自Bio-Rad公司；微滴分析读取仪(美国Bio-Rad)。

1.2 样本制备

针对市场上常见的鸡、鸭、猪、羊等牲畜类饲料等10种产品进行本底实验，每种平行3次。

1.3 增菌培养

采用均质器将样品配制进行拍打制成1∶10的样品溶液。金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌按照GB/T 23743方法进行；阴性菌株增菌。

1.4 DNA的提取

取上述培养的增菌液各1 mL均加到1.5 mL无菌离心管中，按照常规CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取模板DNA。

1.5 PCR扩增

金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列、蜡样芽孢杆菌的16 s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定。……