罗怡琳 ， 田 浪 ， 许娃丽 ， 罗卓琳 ， 吴保庆

(广东海大集团股份有限公司 ， 广东 广州 511400)

大肠杆菌病在我国养殖场中较为流行，且发病率和死亡率高居不下，对畜禽养殖行业的发展造成了严重的威胁，并带来了巨大损失[1]。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)血清型多达50种[2]，有研究表明，即便是同一地区不同养殖场间的优势血清型也不尽相同。长期以来为了控制大肠杆菌病的发生[3]，抗菌药被广泛、大量且不规范的使用在临床养殖上，因此导致大肠杆菌的耐药问题愈发严重。当前，为了响应并遵循国家农业农村部无抗饲料的相关规定，寻求具有地域针对性的抗菌药物成为研究热点。

中药作为我国国粹之一，具有资源丰富、价廉易得、安全无残留、不易产生耐药性等优点，因此成为当前寻找抗菌药替代品的重要来源。许多中药具有抗菌作用，部分中药还可逆转细菌耐药性，提高耐药菌对抗菌药的敏感性[4-7]。本试验通过选取14种已报道的对家禽大肠杆菌具有抑制作用的中药，对2株大肠杆菌标准菌株以及22株广东地区临床分离的大肠杆菌进行体外抑菌试验，旨在筛选出对广东地区大肠杆菌临床菌株有抑菌作用的中药，为临床大肠杆菌病的用药提供参考，同时也进一步为中药逆转细菌耐药性研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 中药 板蓝根、白头翁、大青叶、大黄、金银花、鱼腥草、五倍子、蒲公英、黄芩、秦皮、黄连、苦参、穿心莲、黄柏，均购自广东省广州市大参林药店。

1.2 供试菌株 大肠杆菌ATCC25922、ATCC10389，均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；临床分离菌株：22株大肠杆菌菌株(2018年1月—2020年9月从广东各地养殖场患病家禽中分离获得)，由广东海大畜牧水产研究中心分离保存。

1.3 仪器与试剂 超净工作台，购自江苏苏净集团有限公司；SPX型生化培养箱，购自宁波东南仪器有限公司；微量移液器，购自赛默飞世尔科技公司；营养琼脂、MH琼脂、MH 肉汤、K-B纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 中药药液的制备 采用水煎法[8]称取洁净干燥药材剪碎后置于烧杯中，加入10倍量的蒸馏水没过药材约1 cm，浸泡20 min后用电炉微沸腾加热1 h左右，然后使用8层纱布进行过滤，剩余药渣再次加入5倍量的蒸馏水煮沸30 min后过滤，将2次药液合并后离心过滤并进行10倍浓缩，得到浓度为1 g/mL药液，高压灭菌后于4 ℃冰箱保存。

1.5 菌液的制备 将保存的大肠杆菌ATCC25922、ATCC10389标准菌和22株临床分离菌在营养琼脂平板上划线培养后，挑取单个菌落接种于MH 肉汤中培养12～16 h，作为原菌液，备用。

1.6 MH平板的制备 将灭菌后的MH琼脂培养基倾注至无菌干燥的平皿内，待培养基冷却后形成厚度为4 mm 的平板。制成的MH 平板取出1个置37 ℃恒温箱培养24 h做无菌检测，其余用密封袋封好置4 ℃冰箱保存，7 d 内用完[9]。

1.7 抑菌试验

1.7.1 抗菌药体外抑菌试验 采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，通过测量各纸片的抑菌圈大小(mm)，参照《全国临床检验操作规程》及美国临床和实验室标准协会(CLSI)《抗菌药物敏感性试验标准》2013 版，评定为敏感、中敏和耐药。

1.7.2 中药体外抑菌试验 采用管碟法。用无菌棉签蘸取浓度为105～106CFU/mL 的细菌稀释液，涂布于MH 平板上，用无菌镊子将钢管均匀摆放平板上，静置10～15 min，滴加中药药液，加至液面与钢管表面平行即可，每种药物做3个重复。将平板放置于37 ℃恒温箱中培养12～18 h 后，用游标卡尺测量抑菌圈大小，取平均数为统计结果。结果判定：抑菌圈直径≥20 mm为极敏，抑菌圈直径在15～19 mm为高敏，抑菌圈直径在10～14 mm为中敏，抑菌圈直径<10 mm为低敏，无抑菌圈为耐药[10]。

1.8 统计学分析 采用SPSS 18.0 软件对试验数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 抗菌药对临床菌株体外抑菌试验 使用14种不同抗菌药对临床22株大肠杆菌菌株进行抑菌试验，并统计抑菌效果，结果如表1所示，22株临床大肠杆菌对多黏菌素B、头孢曲松、庆大霉素、大观霉素、头孢曲松、新霉素均表现出不同程度的高度敏感，其中对多黏菌素B(20株)敏感度最高；而对林可霉素、利福平、多西环素、新诺明均表现为耐药。

表1 抗菌药对大肠杆菌临床菌株的体外抑菌效果Table 1 In vitro antibacterial effect of antibiotics on E.coli clinical strains

2.2 14种中药对标准菌株的抑菌效果 结果如表2所示，14种中药中苦参、穿心莲、黄柏对标准菌株无抑菌作用，其余11种中药对2种标准菌株表现出不同程度的抑菌效果。

表2 14种中药对大肠杆菌标准菌株的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of 14 traditional Chinese medicines on E.coli reference strains

2.3 14种中药对临床菌株的抑菌效果 14种中药中仅白头翁、金银花、五倍子、秦皮、黄连、大青叶6种对临床大肠杆菌菌种有抑菌作用，且效果均为中效，其中以金银花、五倍子、白头翁3种药物抑菌效果相对最佳(表3)。

表3 14种中药对大肠杆菌临床菌株的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of 14 Chinese medicines on E.coli clinical strains

3 讨论

关于中药体外抑菌的测定方法较多，最为常见的为二倍稀释法、纸片法、管碟法、打孔法等。二倍稀释法在操作过程中需要调节药液的酸碱性，药液的pH对结果影响较大且不易把控，同时颜色较深的药液颜色不便于观测；因根茎部药液淀粉含量较高，液体黏稠度加大，使用打孔法时滴在孔内的药液难以扩散，故以上2种方法都有局限性。纸片法技术上虽简单易行，但纸片所吸附的药量不好确定，且吸附到纸片上的药液又不易扩散，同时在自制药敏纸片时需要反复烘干，对药液中有效物质的挥发有一定影响作用，所以该方法对药物的抑菌效果影响较大[11]。而管碟法不需要对药液进行额外处理，且可以精确的量取药液，试验结果较为准确，故本试验采用此方法进行抑菌试验。

鸡大肠杆菌病是鸡的养殖业中常见的细菌性疾病，发病率高且血清型多，不同血清型对药物的敏感性不一致，不同地区同一血清型的大肠杆菌对药物的敏感性也各不相同[12]。李兰芳等[13]通过对青海省内规模化猪场致病性大肠杆菌的血清型进行鉴定发现，青海省内不同地区的养殖场间的优势血清型也具有明显差异；罗铭等[14]报道显示，玉林市禽、畜养殖场沙门菌的优势血清型间具有显著差异。同时，有学者对致人腹泻的志贺氏菌与非伤寒沙门菌连续8年的菌型变迁进行统计，结果显示，各地对菌型分布的报告不尽相同，即使在同一地区的不同年代，其分布也不完全一致，其耐药情况也有较大改变[15-16]。本试验所分离的大肠杆菌菌种均来自广东地区内不同的家禽养殖场，通过K-B纸片扩散法对22株临床菌种进行药敏试验，结果显示，临床大肠杆菌菌株对多黏菌素B最为敏感。而反观察其他药物对22株临床菌种的抑菌效果发现，同一种药物对不同大肠杆菌菌株会出现较大的差异，如大观霉素对22株菌株的抑菌效果分别为[14.50±3.77(6) R]、[18.71±5.22(7) S]、[15.50±4.77(8) I]，同时出现3种不同判定结果且标准差均较大，该结果表明，同一地区不同养殖场间的同一菌株的优势血清型也不尽相同。

本试验通过查阅了相关的著作和文献[17-20]，选择了金银花和黄连等14 种有显著抑菌效果的中药对22株临床大肠杆菌进行了体外抑菌试验，重点就14种中药对受试菌的抑菌效果和抑菌谱的差异进行了比较和分析，希望能对临床用药提供一些参考。所选的14种中药进行体外抑菌试验结果表明，对于分离的22种大肠杆菌的临床致病菌而言，14种中药中仅白头翁、金银花、五倍子、秦皮、黄连、大青叶6种具有良好的抑制效果，该结果与现有报道有一定的差异性。本试验中发现大黄对临床大肠杆菌无抑制效果，其结果与窦志良[21]所报道的大黄对大肠杆菌无作用结论一致，而与姬志伟等[22]发现大黄对大肠杆菌具有显著的抑制作用这一结论相矛盾。究其原因应与试验药物基源、提取药物的方法、菌株浓度以及药物浓度具有相关性。另外，不同地区不同年份间的菌种之间的优势血清具有一定差异性，同时细菌具有较为复杂的耐药机理，对于中药中的挥发油、鞣质、甙类以及生物碱等有效抑菌成分是否具有类似于抗菌药的耐药性[23-24]，尚需深入研究。

现有研究报道中细菌较少对中药产生耐药性，这一特性为解决细菌耐药问题提供了新的思路，本试验中所筛选出的白头翁、金银花、五倍子、秦皮、黄连、大青叶6种中药也仅针对广东地区家禽大肠杆菌疾病的临床用药有一定的参考价值，其是否适用于其他地区家禽大肠杆菌疾病临床用药还需进一步探讨。同时，本试验结果也提示了摸清细菌性疾病与病毒性疾病的流行性是新药筛选工作的重中之中。