苗田田 李 强 余宏军 刘 鹏 郝 佳 蒋卫杰

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黄瓜（Cucumis sativusL.）起源于亚热带地区，喜温不耐寒，对低温敏感性较高（安志信 等，2006）。我国是世界上黄瓜栽培面积最大的国家，作为设施栽培最重要的蔬菜作物之一，随着设施栽培的普及推广，黄瓜在我国北方地区的反季节栽培中易受到低温影响，引起产量和品质的大幅度下降（李彩霞 等，2019）。在我国冬季和早春栽培中黄瓜受到低温伤害，幼苗生长缓慢或者停止生长，叶片黄化萎缩，严重时能够造成植株死亡（李淑菊等，2020）。因此，提高黄瓜的低温抗性在生产中有重要作用。

肌醇（inositol），又称环己六醇，分子式为C6H12O6，相对分子质量为180.16，有9 种异构体，较重要且普遍存在的是肌肉肌醇（myo-inositol，MI）（杨楠 等，2017），本试验中使用的肌醇即肌肉肌醇。肌醇在植物生长和发育过程中参与信号传导、营养储存、细胞壁生成、渗透调节（Majumder et al.，1997；Loewus &Murthy，2000；Pendaries et al.，2005；Sengupta et al.，2012）等生命活动。肌醇也是抗坏血酸（ascorbate，ascorbic acid，AsA）的底物之一（图1），AsA 作为植物重要的抗氧化剂，在植物受到低温、强光、盐胁迫和干旱等胁迫时含量增加，它是植物体内活性氧（ROS）清除剂（Rao et al.，1995；Mittler，2002；Yurena et al.，2014）。肌醇合成AsA 过程中的关键酶是肌醇加氧酶（MIOX），研究发现，与野生型拟南芥相比，过表达MIOX转基因拟南芥植株AsA 含量增加了2～3 倍（Lorence et al.，2004），过表达MIOX转基因植株叶片肌醇含量显著低于野生型拟南芥肌醇含量（Endres &Tenhaken，2009）；在转基因SlMIOX番茄上外施肌醇能够提高AsA 含量，同时提高番茄的逆境抗性（Munir et al.，2020）。

肌醇作为细胞中重要的一类糖类物质，近年来开始受到人们关注。胁迫条件下外施肌醇的水稻、玉米和小麦幼苗抗氧化酶活性显著提高，丙二醛（MDA）和过氧化氢含量显著降低（郭元飞 等，2014；姚慧和夏凯，2014；袁红梅 等，2014）。大麦发芽过程中添加肌醇、α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶和库尔巴哈值都显著提高（张善飞 等，2012）。但是目前外施肌醇在蔬菜上的应用以及对肌醇代谢相关基因水平变化的研究还鲜见报道。本试验以黄瓜材料9930 为研究对象，苗期低温条件下喷施肌醇，观测在冷胁迫下黄瓜外观、干鲜质量变化，以及植株抗冷性相关生理指标；并采用RT-PCR 技术，分析肌醇代谢相关基因在低温胁迫下的响应和水平变化，为外施肌醇对黄瓜抗冷性的影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017 年10—12 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培课题组人工气候室内进行，选用材料为黄瓜（Cucumis sativus）遗传背景清晰的测序品种 9930（由本所顾兴芳老师赠与，本课题组自行繁种）。选取饱满的黄瓜种子进行催芽，用50 ℃温水浸泡30 min，5%次氯酸钠溶液遮光浸泡15 min，清水冲洗2～3 次，放置于28 ℃恒温培养箱中培育24 h，种子露白后在穴盘中播种育苗。待黄瓜长至三叶一心，选用生长状态一致的幼苗进行低温和1 次喷施肌醇处理。肌醇浓度为0.8 g·L-1，由国药集团生化试剂公司提供。

1.2 试验处理与取样时间

试验分别在常温和低温人工气候室进行，相对湿度为65%，光照强度为150 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h/12 h（昼/夜）。设置3 个处理：常温对照（CK），昼夜温度为28 ℃/18 ℃，叶面喷施0 g·L-1肌醇（即喷施蒸馏水，下同）；低温对照（T1），保持昼夜温度为6 ℃，叶面喷施0 g·L-1肌醇；低温处理（T2），保持昼夜温度为6 ℃，叶面喷施0.8 g·L-1肌醇，以叶片均匀附着一层小水珠为准。每个处理100 株，3 次重复，每个重复包含3 株黄瓜叶片。

1.3 植物生物量的测定

低温处理72 h 后，将CK、T1 处理和T2 处理的黄瓜幼苗转移至常温条件下培养6 d 回暖，回暖后用万分之一天平测定植株鲜质量，将植株鲜样置于烘箱105 ℃杀青15 min，80 ℃恒温72 h，然后用电子天平称量植株干质量。

1.4 电解质外渗率的测定

电解质外渗率的测定参考张平艳等（2014）的方法，分别在低温处理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黄瓜叶片样品，每个处理用打孔器取0.5 g鲜样，用蒸馏水洗净后浸泡在20 mL 蒸馏水中，抽气3 次，每次20 min，放置2 h，其间多次摇动，测定此时的电导率，记为EC1。将组织沸水浴10 min，使得组织完全被杀死，冷却至室温后测定此时的电导率，记为EC2。同时测定蒸馏水的电导率记为EC，试验重复3 次。电解质外渗率（El）的计算公式为：El=100 ×（EC1 -EC）/（EC2 -EC）。

1.5 生理指标的测定

分别在低温处理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黄瓜叶片样品，AsA、总抗坏血酸（Total AsA，T-AsA）和脱氢抗坏血酸（DHA）含量参照Zhang 等（2016）的方法测定；脯氨酸、丙二醛含量的测定参考王学奎（2006）的方法；采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，中国）测定H2O2、含量；采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，中国）测定抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）活性；可溶性糖和可溶性蛋白含量分别采用蒽酮比色法和考马斯亮蓝染色法测定。

1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

分别在低温处理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黄瓜叶片，叶片用锡纸包裹迅速置于液氮中，保存在超低温冰箱中。采用Trizol 方法提取植物样品中的总RNA（Zhang et al.，2016），用灭菌的超纯水溶解RNA，并用NanoDrop（Bio-Rad，美国）测定样品RNA 浓度和OD260/OD280值，然后根据所测浓度调节最终RNA 浓度为1 000 ng·μL-1，并用试剂盒（Fermentas，美国）对样品RNA 进行反转录，反转录合成的cDNA 即为qRT-PCR 的模板。qRT-PCR 的体系共15 μL，其中包含：7.5 μL iQ SYBR Green Supermix，目的基因上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，cDNA 模板0.75 μL，灭菌超纯水6.15 μL。试验中全部的qRT-PCR 均以黄瓜管家基因Actin作为内参基因，其荧光定量值作为计算内标，参照Livak 和Schmittgen（2001）的2-ΔΔCt方法计算样品目的基因相对表达量，每个样品均设置3 次技术性重复。

试验中根据测序黄瓜9930 材料数据库中的基因序列，用Primer 5.0 设计不同目的基因的特异性引物（表1），所有引物合成和测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。qRT-PCR 将在iQTM5 多重实时荧光定量PCR 仪器（Bio-Rad，美国）上进行，具体程序为：95 ℃预变性30 s；40个PCR 循环（95 ℃变性5 s，再60 ℃退火30 s）；溶解曲线分析以20 ℃·s-1快速升温至95 ℃，迅速降低（20 ℃·s-1）至65 ℃持续15 s，再以0.1 ℃·s-1的速度升高至95 ℃，在达到退火温度时采集荧光。

表1 特异性引物设计

1.7 数据处理

采用SPSS 16.0 软件进行数据处理及结果分析，采用Duncan 法进行多重比较及差异显著性分析。采用Graphpad Prism 5.0 作图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下外施肌醇对黄瓜幼苗长势、幼苗生物量和电解质外渗率的影响

由图2 可以看出，低温处理72 h 后，T1 处理的植株第1 片真叶叶脉变黄，第3 片真叶整体变黄失绿且萎缩，T2 处理的植株第1 片真叶叶边缘变黄，第3 片真叶受伤害较小。

低温胁迫回暖6 d 后，T2 处理的植株干、鲜质量均显著高于T1 处理，但显著低于CK，可见低温胁迫下植株干、鲜质量降低，喷施肌醇对黄瓜幼苗冷害有缓解作用。低温胁迫下植株的电解质外渗率明显增加，且呈持续升高的趋势。低温处理后0～12 h，T1 和T2 处理的电解质外渗率升高但两处理间无显著差异，处理24 h 后T1 处理的电解质外渗率显著高于T2 处理。其中低温处理48 h 时T1 与T2 处理相差最大，T2 处理的电解质外渗率比T1 处理降低了20.44%（图3）。

2.2 低温胁迫下外施肌醇对黄瓜幼苗抗坏血酸含量的影响

由图4 可知，在低温条件下黄瓜幼苗叶片中AsA、T-AsA 和DHA 含量呈现先增加后降低的趋势。T2 处理的AsA 含量在处理后12 h 达到最大值，此时T2 和T1 处理分别比CK 增加了131.27%和46.49%；在处理后12 h 和24 h，T2 处理的AsA 含量显著高于T1 处理，且在处理后72 h，T2 处理的AsA 含量显著高于T1 处理和CK。T2 处理的T-AsA含量在处理后12 h 达到最大值，是CK 的2.91 倍，T1、T2 和CK 三者之间呈现显著差异。低温条件下T1 和T2 处理的DHA 含量整体看来没有显著差异。在低温处理后3 h 时，T2 处理的DHA 含量显著高于CK；低温处理后12 h 和24 h，T1 和T2 处理的DHA 含量显著高于CK；而在低温处理后72 h，T1 和T2 处理的DHA 含量显著低于CK。

2.3 低温胁迫下外施肌醇对黄瓜幼苗MDA、H2O2、和渗透物质含量的影响

随着低温处理时间的延长，黄瓜幼苗叶片中的MDA 含量呈持续升高的趋势（表2），处理48 h 时，T1、T2 和CK 三者之间的MDA 含量差异显著，与CK 相比，T1 和T2 处理的MDA 含量分别增加了103.03%和75.76%。低温处理6～72 h，T1 和T2处理黄瓜幼苗叶片的H2O2含量显著高于CK，且T1 处理在低温后12～48 h 一直显著高于T2 处理。低温处理3～6 h 和24～72 h，T1 和T2 处理的含量显著高于CK，在低温处理48～72 h，T1 处理的含量显著高于T2 处理。

低温处理后黄瓜幼苗叶片中脯氨酸含量显著高于CK，处理24 h 时T2 处理的脯氨酸含量显著高于T1 处理，比T1 处理提高了155.50%。随着低温处理时间的延长，黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趋势，T1 和T2 处理的可溶性蛋白含量从处理12 h 开始显著高于CK。低温处理下黄瓜幼苗叶片中可溶性糖含量整体呈增加的趋势，在低温处理24 h 和48 h，T2 处理的可溶性糖含量显著高于T1 处理，分别比T1 处理高出54.62%和17.02%；在低温处理72 h 时，T1 和T2 处理的可溶性糖含量与CK 相比分别提高了124%和149%，均与CK 差异显著。

2.4 低温胁迫下外施肌醇对黄瓜幼苗抗氧化酶的影响

如图5 所示，与CK 相比，T1 和T2 处理的抗氧化酶活性均有提高的趋势。在低温处理后0～6 h 内，T1、T2 处理的SOD 和POD 活性没有显著差异；低温处理24 h 后，T2 处理的SOD 和POD活性一直高于T1 处理，且24 h 时达到最高，并与T1 处理差异显著；在72 h 时，T2 处理的POD 和CAT 活性显著高于CK 和T1 处理，此时T2 处理的POD 和CAT 活性分别比CK 提高了62.44%和83.87%。

2.5 低温胁迫下外施肌醇对黄瓜幼苗肌醇代谢相关基因表达水平的影响

由图6-A 可见，低温处理和外施肌醇能够显著影响肌醇代谢相关基因的表达水平。肌醇代谢相关酶有肌醇半乳糖苷合酶（Gols）、磷脂酰肌醇合酶（PIS）和肌醇加氧酶MIOX（Taji et al.，2002；Pendaries et al.，2005；Zhuo et al.，2012），其中肌醇加氧酶基因CsMIOX1迅速响应，低温处理后3 h 其表达水平显著高于其他基因，T2 处理的CsMIOX1基因相对表达量超出T1 处理的2 倍左右。对CsMIOX1基因进行低温处理72 h 内水平变化分析发现（图6-B），低温胁迫处理3～12 h，CsMIOX1的相对表达量增加，且外施肌醇的T2 处理的CsMIOX1的相对表达量一直显著高于T1 处理，3 h 时T2 处理CsMIOX1的相对表达量最大，与CK 相比，T1 处理和T2 处理的CsMIOX1表达量分别上升了3.68 倍和10.64 倍；12 h 时，T1、T2处理与CK 相比分别上升1.44、3.65 倍。在处理后期，T2 处理和T1 处理的CsMIOX1表达水平没有显著差异。说明低温条件下外施肌醇能够改变肌醇代谢基因的表达水平，其中CsMIOX1基因水平强烈响应低温胁迫和喷施外源肌醇。

3 讨论与结论

低温胁迫是影响植物正常生长的不利因素之一，尤其是早春和冬季黄瓜设施栽培中，低温是作物生长的主要限制因子。有研究发现外源肌醇能够提高水稻低温抗性（郭元飞 等，2014），但是肌醇在蔬菜作物上的应用研究鲜有报道。与常规喷施外源物质不同的是，肌醇是AsA 合成过程肌醇途径的底物，说明肌醇除了作为渗透物质调节细胞渗透压，还可以作为底物合成关键的抗氧化物质AsA（Valluru &Ende，2011）。AsA 作为植物逆境条件下产生的非酶抗氧化物质，在植物受到低盐、臭氧、紫外线、低氮、低温胁迫时含量提高（Zhang et al.，2016），AsA 能够将H2O2还原为脱氢抗坏血酸（DHA），AsA 和DHA 在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中相互转化（许英 等，2015）。本试验结果表明，整体来看，低温胁迫下黄瓜幼苗中AsA 和T-AsA含量有所增加，且喷施肌醇可以进一步提高AsA及T-AsA 的含量。

本试验中低温处理初期，T1、T2 处理的黄瓜幼苗MDA、H2O2和含量显著增加，但是二者没有显著差异。植物受到胁迫产生活性氧激活抗氧化酶系统，通过自身抗氧化酶活性来清除活性氧维持正常代谢（Miller，2004；Rubio et al.，2005），低温处理开始阶段喷施肌醇的T2 处理的抗氧化酶系统活性和渗透物质含量与未喷施肌醇的T1 处理没有显著差异。低温处理12 h 时，T2 处理的AsA和T-AsA 含量最高，且显著高于T1 处理；此时T2 处理的H2O2含量显著低于T1 处理，但T1 和T2 处理的抗氧化酶系统活性还没有显著差异。低温处理3 h 时，与CK 相比喷施肌醇的T2 处理的DHA 含量显著增加，说明低温开始后植株内已有的AsA 在清除活性氧之后被氧化为DHA（Noctor，2006）。低温处理12～48 h 时，T2 处理的H2O2含量一直显著低于T1 处理，从24 h 开始，T2 处理的SOD 和POD 活性才开始高于T1 处理，抗氧化酶活性的升高使植株抗性增加（钱恒彦 等，2019），此时T2 处理的脯氨酸和可溶性糖含量显著高于T1处理；至低温处理48 h 时，T2 处理的过氧化氢含量、含量、MDA 含量均显著低于T1 处理，可能是由于植株累积的AsA 能够清除活性氧，减少了抗氧化酶系统压力，从而植株受低温损伤较小。以上现象说明，在低温处理开始后，外施肌醇的植株内迅速累积AsA，叶片吸收肌醇后生成更多的AsA（Lorence et al.，2004；Endres &Tenhaken，2009），这个结果与在转基因番茄上饲喂肌醇提高了AsA 含量结果一致（Munir et al.，2020）。

有研究发现MIOX基因与抗性显著相关。MIOX基因受环境胁迫调控，干旱条件诱导MIOX表达，过表达MIOX基因能够提高植株抗氧化酶活性和抗碱性，在水稻中过表达OsMIOX能够通过降低转基因植株内自由基含量来提高水稻抗旱性（王海光 等，2007；Duan et al.，2012；Chen et al.，2015）。与野生型植株相比，过表达MIOX4拟南芥转基因植株的AsA 含量提高了2～3 倍（Lorence et al.，2004）；饲喂肌醇后过表达MIOX转基因拟南芥内肌醇含量一直低于野生型植株（Endres &Tenhaken，2009）。根据本试验研究结果，低温处理诱导黄瓜幼苗CsMIOX1表达，外施肌醇后肌醇加氧酶作用的底物增加，CsMIOX1进一步被诱导表达，从而生成更多抗坏血酸抵抗低温胁迫，此结果与Munir 等（2020）的研究结果一致。

本试验结果表明，低温胁迫下外施肌醇能够显著增加植株干鲜质量，降低电解质外渗率，缓解低温损害。肌醇作为底物生成更多抗坏血酸，抗坏血酸的累积能够清除活性氧，抗氧化酶系统活性升高；此外，肌醇加氧酶基因表达水平在外施肌醇后显著上升，进一步说明MIOX 发挥作用使肌醇生成了更多抗坏血酸。综上所述，外施肌醇能够提高黄瓜幼苗的抗坏血酸含量和抗氧化酶活性，提高植株的抗冷性。