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黄绿蜜环菌的研究进展*

2021-03-12刘西周王润楠

中国食用菌 2021年1期
关键词:黄绿菌丝体含量

刘西周,王润楠

(天津师范大学生命科学学院,天津市动植物抗性重点实验室,天津 300387)

黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens),又名黄蘑菇、皇菇、双环菌,属于担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲 (Hymenomycentes)口蘑目 (Tricholomatales)口蘑科 (Tcholomataceae)蜜环菌属(Armillaria),主要分布于青藏高原地带[1],作为我国重要的高原生物资源,近年来被科研工作者广泛关注。通过全面综述黄绿蜜环菌的研究进展,以对其发展前景进行展望。

1 形态学特征

1997年刁治民[2]提到,黄绿蜜环菌菌盖呈扁平状,菌盖边缘内卷,新鲜时菇体表现为柠檬黄色至琉璃色,不等长;菌柄内实,长2 cm~8 cm,直径2.0 cm~2.5 cm,呈圆柱状,白色至黄色,茎部膨大背阳处晾干呈近白色,不粘,鳞片明显,菌盖5 cm~12 cm;菌肉肉质细腻,白色至浅黄色,伤后不变色,有特殊的菌香气味;菌褶黄色,大多直生,少数弯生至菌盖;内菌明显,白色至浅黄色,棉絮状至近膜质,在菌环形成后消失;菌环单层,以上为白色,以下为黄色。

通过显微镜观察孢子体,可以发现担孢子呈椭圆形,无色至浅黄色,淀粉质,(6.4~7.8)μm ×(4.0~4.8)μm;担子棒状,(22~28)μm ×(4.0~5.4)μm,无色,具4孢,菌丝具有明显的锁状联合[2]。

2 生态环境

2.1 自然分布

黄绿蜜环菌主要分布于我国的西南地区,尤其是青藏高原地带,甘肃、四川、陕西、河北也有少量分布,夏秋季生长在低温、高海拔的蒿草草甸或草原上,单生、散生、野生,常形成蘑菇圈[3]。在青海,黄绿蜜环菌分布于3 000 m~4 300 m高海拔地区,3 200 m~3 800 m的草甸上更为集中,主要产于果洛、海南、黄南、海北。近几年,关于黄绿蜜环菌的自然分布也有了新的论述,赵联正[4]在2015年提到,黄绿蜜环菌分布范围为北纬 28°93′~37°69′、东经 90°4′~102°1′,这与蒿草属植物的分布相吻合,而在陕西、河北则没有分布。

2.2 气候因子

2.2.1 气温

黄绿蜜环菌由于分布于3 000 m~4 300 m的高海拔地区,生长区较为寒冷,菌丝生长的草场气温在一年中有5个月~8个月在0℃以下,每年的5月至9月为牧草的青草期[5]。据周劲松[6]研究,野生黄绿蜜环菌分布区的年平均气温为0.8℃(刚察)至-4.2℃ (玛多),最冷月气温为-14.2℃ (刚察)、-16.9℃ (玛多),最热月气温为 10.6℃ (刚察)、7.6℃ (玛多),气温年较差为 24.8℃ (刚察)、24.5℃(玛多),年平均降水量为377.1 mm(刚察)、282.8 mm(玛多)。春季干旱。

2.2.2 降水

每年的7月中旬至8月下旬为出菇期,降雨周期和降雨量对黄绿蜜环菌的发生时间、发生量产生重要影响。如果降雨早、降雨量多并且集中,则子实体发生早,产量也会提高,子实体发生期的雨量为300 mm~500 mm[7]。在青藏地区,每年的6月~8月降水较多,约占年降水量的70%[7]。由于黄绿蜜环菌牧草生长期短,生长的草甸气温低,蒸发量较少,所以保持水分对菌丝生长起着重要作用,每年8月降水次数多,有助于提高黄绿蜜环菌的产量,每公顷可产子实体 600 kg~900 kg[7]。

2.2.3 土壤

于是除了沉潜于作画(仅1958年就创作了200多幅作品,可谓是一个人的大跃进)潘天寿再次有了辞职的念头,却未能如愿,他不知道,在毛泽东那个讲话后,即使有人真对他有意见,也不敢轻易动他,所以越请辞越升职。

黄绿蜜环菌生长在高山草甸土,腐殖质层10 cm~20 cm,土壤颜色较深,呈中性或偏碱性,腐殖质层以下为母质,含草根、砾石[2]。在雨后,该土不会产生积水,长时间干旱后仍然保持湿润,特别适宜黄绿蜜环菌的生长。通过对祁连县黄绿蜜环菌生长区土壤进行成分测定,结果为速效氮445.6 mg·kg-1、速效磷 5.86 mg·kg-1、有机质 8.84%、全氮 0.415%、全磷0.079 4%[2]。蘑菇圈土壤各营养成分含量对比详细数据见表1。

表1 蘑菇圈土壤各营养成分含量对比Tab.1 Contents of soil nutrients on fairy ring of Armilaria luteo-virens and outside of ring

由表1可知,在青海省祁连县峨堡乡,王启兰等[8]通过调查发现在0~10 cm土层中,蘑菇圈上的土壤含水量、氨态氮、硝态氮、速效磷的含量明显高于圈外,交换性Mg2+、交换性Ca2+、土壤有机质和pH则没有明显差别;在10 cm~20 cm土层中,土壤含水量变化趋势相反,其与赵勇斌[9]的观点相吻合。蘑菇圈土壤微生物数量对比详细数据见表2。

表2 蘑菇圈土壤微生物数量对比Tab.2 Numbers of soil microorganisms on fairy ring and outside of ring

由表2可知,王启兰等[8]也调查了峨堡乡土壤中微生物的数量,发现在0~10 m土层,蘑菇圈上细菌、真菌、放线菌的数量,都显著高于圈外(P<0.05),但是在10 cm~20 cm土层,微生物数量差异并不显著(P>0.05)。当土壤深度不断增加时,各种微生物的数量、种类迅速下降,在2层土壤中细菌数量最高,其次是放线菌,真菌的数量最低。

2.3 植被

黄绿蜜环菌生长发育的植被均为草本,主要生长在高寒草甸、高寒草原等植被类型中。黄绿蜜环菌共生植物均达到8种~17种,黄绿蜜环菌共生植物优势种为矮蒿草 (Kobresia humilis)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)、羊茅 (Festuca ovina)、高山蒿草(Kobresia pyymaea)、甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis)、青海固沙草 (Orinus kokonorica)、柄状苔草(Carex pediformis)等,通过研究子实体具体发生的部位,可以看出黄绿蜜环菌与蒿草属和苔草属共生植物的根系形成了菌根关系[10]。研究发现黄绿蜜环菌生长区域出现了明显的“带状”增绿颜色,发现增绿带的Ca、P元素含量以及叶绿素明显高于非增绿带,其他指标略低于后者,这似乎意味着黄绿蜜环菌存在具有某种促进草增绿的机制,或者在生长过程会分泌将草变绿的化学物质,关于这一论点还需要进一步探索。通常“带状圈”的直径大约为6 m,宽度为20 m~30 m,圈上植物颜色更深,生长更茂盛。圈上一共有26种植物,平均总盖度位为90.2%,各物种分盖度总和为 143.72%[11]。

3 成分分析

3.1 营养成分

黄绿蜜环菌营养丰富,通过分析子实体的干样品,发现每100克干样品中,存在干物质95.29 g、粗蛋白质 38.71 g、粗脂肪 15.28 g、粗纤维 8.04 g、无氮浸出物 25.13 g、灰分 8.13 g、钙 0.13 g、磷0.64 g、总热量 18 045 J·g-1[2]。此外,氨基酸种类也十分丰富,存在18种氨基酸,含有较多维生素,VB1含量 1.84 mg·g-1、VB2含量 8.25 mg·g-1、VC 含量 12.81 mg·g-1、铁含量 329 mg·kg-1[2]。通过对比祁连、泽库、玛沁数据,可以发现不同产地的黄绿蜜环菌营养物质成分不同。

3.2 矿质元素

魏永生等[12]利用全谱直读电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES),详细分析、测定了矿质元素含量,黄绿蜜环菌共含有17种矿质元素K、P、S、Mg、Ca、Fe、Al、Na、Zn、Cu、Mn、Cd、Ti、B、Ba、Cr、Sr,其中K、P、S的含量较高;此外,微量元素Fe、Zn、Cu等含量较高,同时含有一定量的Cd元素,但是并未检测出Se元素。

3.3 有效成分

关于黄绿蜜环菌有效成分的研究较多,主要是经过水提取或者有机溶剂提取、分离子实体,经过现代仪器设备纯化、鉴定,对子实体进行定性定量分析,分离蛋白质、氨基酸、挥发性物质等,确定有效成分。

白世俊等[13]将黄绿蜜环菌子实体分别进行水提取、醇提取、石油醚提取等方法,定性分析了其化学成分,表明该菌含有较丰富的糖类、生物碱、氨基酸、蛋白质和少量皂苷、强心苷、苷类、甾体三萜类、有机酸、黄酮等,而香豆素萜类、挥发油、鞣质、酚类极少。马琳等[14]利用反向/亲水二维制备液相色谱法,获得子实体水提取物,分离纯化得到单体化合物,经过鉴定确定了7个有效成分焦谷氨酸、尿嘧啶、2’-脱氧尿苷、尿苷、肌苷、腺苷、鸟苷,这7个化合物均为首次分离得到。唐楚沉等[15]将黄绿蜜环菌子实体进行了丙酮提取,先用固相萃取(solid-phase extraction,SPE)技术进行预处理,再采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法进行分析,最终鉴定出33个化合物,主要是烯类、酯类、脂肪酸类等化合物,其中含量最高的是亚油酸(48.2%),其次含量较高的有邻苯二甲酸丁辛酯(12.1%)、顺式-11-十八碳烯酸(7.1%)、邻苯二甲酸单酯(7.3%),其余成分均在5%以下。

刘葳等[16]通过80℃水浸提,sevagHO2溶液脱色,体积分数为95%的酒精沉淀得到粗多糖GLP,产率为1.72%;通过纯化得到2种白色粉末状多糖粗品阿拉伯糖和木糖,该多糖由α-D-木吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖组成,连接方式以1、4连接为主链,1、6连接为支链。魏永生等[17]利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry,SPME-GC-MS),研究了黄绿蜜环菌子实体的挥发性成分,发现挥发性物质中含量最高的是3,7-二甲基癸烷 (13.89%),其次是姜烯(9.10%)、2,3-二甲基十二烷 (8.76%)、佛手柑油烯 (4.62%)、十八烷(3.65%)、2-壬酮 (3.41%)、2,3,5,8-四甲基癸烷(2.89%)、姜黄烯 (2.83%)、6-辛烯-2-酮(2.80%)、β-红没药烯 (2.42%)。周劲松等[18]通过应用气相色谱-质谱联用技术,研究了黄绿蜜环菌子实体的挥发油成分,发现了13种成分,主要是不饱和脂肪酸,如N-苯基-1-萘胺、C14酪、麦角甾-7-烯,3-醇等。索朗央宗等[19]先采用氯仿-甲基叔丁基醚提取黄绿蜜环菌中的总脂肪酸,通过硫酸催化甲酯化后,再用气相色谱-质谱联用对其进行检测,最终有16种脂肪酸被分离检测出,其中饱和脂肪酸有9种,棕榈酸(25.32%)、硬脂酸(12.61%)含量较高,不饱和脂肪酸有7种,油酸(28.33%)、γ-次亚麻油酸(23.14%)含量较高。

4 分子生物学研究

利用现代分子生物学技术研究黄绿蜜环菌,可以对其发展、保护、驯化有重要作用。李海波等[20]运用rDNA-ITS和rDNA-IGS-1测序技术,对黄绿蜜环菌进行分子鉴定、序列比对、构建系统发育树,结果表明:对黄绿蜜环菌进行ITS系统发育分析后发现其与口蘑科内其他属间物种的系统发育关系较远;再将其进行IGS-1系统发育分析,发现其与蜜环菌属的其他种有较大的序列差异,系统发育关系也较远,但是其与环柄菇属(Lepiota)有较近的系统发育关系。李颖等[21]以CTAB法提取的黄绿蜜环菌DNA为模板,通过正交设计试验,建立了适合黄绿蜜环菌SSR-PCR反应的最佳体系,在15 μL反应体系中包括 1×PCR Buffer,模板 DNA 100 ng,dNTPs 217 μmol·L-1,引物 0.5 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶 0.75 U,Mg2+1.3 mmol·L-1。同时还从 34 对引物中,筛选出8对多态性丰富、扩增条带清晰的SSR引物。邢睿等[22-23]利用454焦磷酸测序技术,对黄绿蜜环菌转录组进行测序,通过设计、PCR扩增、电泳、检测,筛选出符合要求的微卫星引物。并利用采集自3个不同居群的66个个体对成功开发出27对具有多态性条带的微卫星引物进行试验,有17对引物符合Hardy-Weinberg平衡且没有连锁不平衡现象,开发的EST-SSR引物为黄绿蜜环菌遗传多样性分析、种质资源鉴定及遗传图谱的构建奠定了基础。当前,关于黄绿蜜环菌的分子生物学研究依然很少,随着科学的不断发展,未来的重点与难点将会在分子水平上研究其子实体的生长发育。

5 菌丝体培养

关于黄绿蜜环菌的菌丝体培养,近几年一直都不断有报道,大致有2个方向:控制单一变量,筛选菌丝体培养的最佳碳源、氮源、碳氮比、温度、pH和最适宜培养条件;将一些物质如盐溶液、生长调节剂、中草药浸提液加入到培养基中,观察菌丝体生长情况(促进、抑制或无影响)。

刁治民[24]最早在1997年提到,黄绿蜜环菌对碳源利用广泛,葡萄糖、蔗糖、淀粉是理想碳源;对氮源的利用率,复合有机氮源>单一有机氮源>铵态无机氮源>硝态无机氮源,对硝态氮的利用率低,甚至基本上不利用;添加维生素、CuSO4、MgSO4等物质时,可以促进菌丝体生长;在无碳源或氮源培养基上不生长。此外,不同的碳氮比也会让菌丝体生长产生差异,当碳氮比范围为5∶1~80∶1时,菌丝体可以生长,最佳碳氮比为35∶1[25]。柳焕章等[26]对黄绿蜜环菌菌丝体培养进行了初步探索,通过试验筛选出了适宜的温度和pH,菌丝体在10℃~35℃可以生长,适宜温度在25℃~30℃;在pH为4~10的环境下可以生长,适宜pH大约为6~7。蔡箫等[27]通过人工驯化黄绿蜜环菌,发现菌丝体生长的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为蛋白胨,适宜的碳氮比为10∶1,最佳矿质元素为MgSO4,最适pH为6.5,暗培养最佳。史强强等[28]以母种为材料,通过单因素试验、正交设计,通过测量菌落直径和菌丝体干重,筛选出了菌丝最佳培养条件,即马铃薯浸出液20%、黄豆芽浸提液 10%、KH2PO40.3‰、VB1和 VB2各 1 mg·L-1。

周劲松等[29]使用了2种生长调节剂(三十烷醇、肌醇)对黄绿蜜环菌菌丝体进行研究,结果发现2种生长调节剂对菌丝生长都有促进作用,但是三十烷醇更明显地提升菌丝体的生长速度。周连玉等[30]将野菊花、枸杞、灵芝、锁阳、甘草、当归等中草药浸提液加入到培养基中,进行菌丝体培养,结果发现灵芝抑制菌丝体生长,其余草药促进菌丝体生长,甘草和枸杞有较强作用,最佳添加量均为4.0%。此外,在液体培养基加入Na2SeO3,发现当浓度为0.80 mmol·L-1时,黄绿蜜环菌菌丝体生长最好,硒可以促进菌丝体生长,在培养的第4天加入亚硒酸钠最适宜,培养7 d可以显著提高菌丝生物量[31]。

6 发酵工艺

目前,关于黄绿蜜环菌发酵工艺的报道不多,肖前青[4]对菌丝体多糖发酵进行研究,获得了多糖发酵模型方程,得到优化条件为蔗糖5 g·L-1、草酸铵0.5 g·L-1、牛肉膏 0.5 g·L-1、K2HPO43 g·L-1、VB10.05 mg·L-1,并初步总结了多糖发酵工艺和提取工艺。王虹等[32]通过正交试验法,分析了2种不同培养基对黄绿蜜环菌液体发酵产胞外多糖的影响,获得了黄绿蜜环菌胞外多糖较优的精制培养基组成:马铃薯 200 g·L-1、酵母膏 2 g·L-1、葡萄糖 40 g·L-1、硫酸镁 0.5 g·L-1、磷酸二氢钾 1.5 g·L-1、维生素 B112 μg·L-1,pH 6.0。余梅[33]通过研究 70 L 发酵罐中的液体培养动力学,建立了液体培养菌丝体的动力学模型。史强强等[34]通过考察摇瓶装量、搅拌速度、发酵时间、接种量等指标,并通过正交设计试验,确定了最优深层发酵工艺参数:摇瓶装量300 mL·L-1、搅拌速度125 r·min-1、发酵时间10 d、接种量15%,为黄绿蜜环菌的工业化生产提供了理论支持。

7 应用价值

7.1 药用价值

黄绿蜜环菌作为一种重要的食药兼用菌,营养丰富、香气扑鼻,含有丰富的蛋白质,平均100 g干样品中就存在蛋白38.71 g,且氨基酸、维生素种类丰富,还含有铁、锌、铜等微量元素,特别是硒元素含量很高[7]。硒元素对汞、镉等重金属有解毒作用,可以调节氧化还原反应速率,调节人体消化、吸收维生素,增强某些酶系统的活性,是人体谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分[35]。此外,黄绿蜜环菌具有补充人体营养、促进食欲,预防脚气病、神经炎,抗流感病毒,促进小儿发育等重要作用,其有效成分的提取物可以直接作为杀伤肿瘤细胞的天然抗肿瘤活性物质[36]。在清朝年间,黄绿蜜环菌被用来当做贡品,目前市场上干品价格超过了300元/kg,出口更昂贵,出现供不应求的局面,这为市场带来了机遇和挑战[7]。

7.2 生态价值

黄绿蜜环菌是与牧草共生的菌根菌,其可以促进牧草的生长和发育,在蘑菇圈上形成“增绿带”。许多证据表明黄绿蜜环菌蘑菇圈上的物种丰富度明显高于圈外,圈上的土壤含水量、氮元素、磷元素含量也高于圈外。黄绿蜜环菌可以降解木质素、半纤维素等物质,增加土壤中小分子、无机离子的含量,促进圈上植物、微生物的成长;同时,菌丝体的生长也需要植物激素的刺激,需要植物根系分泌物、残体来维持;黄绿蜜环菌作为分解者,在生长过程中需要O2,释放CO2,而植物在发育中,则需要CO2,释放出O2,这说明植物的生长、微生物的活动和土壤养分的转化是相互依存、相互促进[8,37-38]。

8 前景展望

由于黄绿蜜环菌生长在青藏高原,还没有进行充分地开发利用,目前可以从人工驯化、物种保护、深加工工艺等方面开展研究。

8.1 人工驯化

黄绿蜜环菌是与牧草共生的菌根菌,这给人工驯化带来了不小的难度,近些年主要研究其菌丝体培养,但目前为止还未发现成功出菇的案例,进度比较缓慢。目前人工驯化的主要问题有:菌丝体生长速度慢、繁殖效率低、生长周期长;菌丝长势弱,污染率高,抗杂菌能力差;对黄绿蜜环菌生长机制了解不充分。因此,应该进一步了解黄绿蜜环菌的生活史、生态特性,研究其与牧草之间的共生体系,不断探索,偿试开展半人工驯化原生态生产。一旦成熟掌握人工栽培技术,不仅能促进黄绿蜜环菌在全国范围的推广、销售,带来重大的经济效益,而且会促进青藏地区其他物种的开发,带来更大的社会效益。

8.2 物种保护

绿蜜环菌生长环境独特,且纯属野生,每年的产量都很低,近几年由于人工大量开采和人为破坏,野生黄绿蜜环菌的产量在逐年降低,甚至濒危匮乏[11],长此以往,将对黄绿蜜环菌的生长和繁衍产生重要危害。为了保护物种多样性、加强对黄绿蜜环菌的进一步持续开发,必须处理好人与菇的关系,注重长远利益,不要过度开采,妥善处理好人与自然的关系。

8.3 深加工工艺

黄绿蜜环菌集营养、药用、保健价值于一体,一直深受消费者青睐,市场的需求也不断增加,但是对其开发和利用一直处于起步阶段,如何充分有效地利用黄绿蜜环菌成为了当前最重要的课题之一。可以通过盐渍、油渍、糖渍等方式,将黄绿蜜环菌做成罐头或者其他风味食物,比如饼干、香肠等;也可进一步研究利用黄绿蜜环菌子实体,萃取而获得多糖,多糖具有很多功效,如健胃保肝、降血脂、抗血栓、降血压、免疫调节、抗肿瘤等[1],可以将其制成药物制剂、保健品、饮料。这样既降低了保鲜成本,方便了人们的利用,也有助于黄绿蜜环菌的推广,为青藏地区的农民提供一条致富门路。

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