嵇再雄， 李家祺， 王建波

血管介入术是治疗危重肢体缺血的有效方法，但其远期成功仍受到术后高发再狭窄影响［1］。糖尿病引起的下肢动脉病变管径小且时间长，术后远期效果更加不理想［2］。药物洗脱支架可防止再狭窄［3］，但术后血管愈合延迟和晚期血栓形成风险增加使之并不能成为再狭窄长远解决方案［4-5］。介入操作无可避免地损伤动脉内膜，内膜撕裂可导致胶原暴露和持续性炎症。血管损伤血小板、炎性细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）释放血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），刺激其发生去分化。PDGF可与PDGF受体（PDGFR）α或β结合，激活PI3K/Akt、MAPK等多条 信 号 转 导 通 路，导 致VSMC增 殖 和 迁 移［6］，而VSMC过度增殖和迁移是血管介入术后再狭窄的主要原因。目前针对血管新内膜增生和再狭窄的临床药理学干预仍不令人满意，寻找更有效药物防治再狭窄及阐明其潜在机制仍具挑战。酸枣仁是亚洲国家著名传统药物，具有催眠镇定、抗焦虑、抗氧化应激等功能［7-8］。酸枣仁皂苷B（jujuboside B，JuB）作为天然皂苷三萜类化合物，是酸枣仁中主要生物活性成分之一［9］。研究表明JuB具有抗血小板聚集［10］、诱导 肿 瘤 细 胞 自 噬 和 凋 亡［11］、降 低 血 管 张 力［12］、抗 炎症［13］等作用，然而JuB对血管介入术后VSMC增殖和迁移的潜在影响仍未知。本研究旨在对JuB在VSMC生理调节中的作用及其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验药品和试剂

JuB（高效液相色谱法检测纯度≥98%，化学结构C52H84O21，分子量1045.223，上海贝吉斯生物科技中心）；高糖Dulbecco改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-胰蛋白酶（美国Gibco公司）；重组人PDGF-BB（美国R&D公司）；细胞计数试剂盒（CCK）-8（上海翊圣生物科技公司）。

1.2 细胞培养和实验分组

将大鼠胸大动脉VSMC——A7r5（中国科学院生物化学与细胞生物学研究所）置于含10%FBS的DMEM并于37℃、5%CO2湿润条件下培养。取3～5代细胞用于实验。25 ng/mL PDGF-BB刺激A7r5建立损伤模型。实验分为5组：正常对照（NC）组、PDGF-BB组、JuB（10μmol/L）＋PDGF-BB组、JuB（25μmol/L）＋PDGF-BB组、JuB（50μmol/L）＋PDGFBB组。

1.3 CCK-8测定

将5×103个A7r5种入96孔板每孔中，并在37℃下培养过夜以贴壁。细胞达到70%时，吸出培养基，用PDGF-BB（25 ng/mL）和JuB（0、1、10、25、50、100μmol/L）分别处理细胞；向每孔中补充CCK-8溶液10μL，将样品于37°C下孵育2 h；用SpectraMax i3x型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）于450 nm下测试细胞光密度（OD）；基于对照的百分比计算细胞活性（%）。每组设置5个重复孔。

1.4 划痕愈伤实验

将A7r5接种在12孔板中，培养至80%密度，置于含PDGF-BB（25 ng/mL）或JuB（50μmol/L）培养基中培养24 h；用20μL移液管尖在平板上划出一道笔直划痕，24 h后用倒置显微镜（×50，德国Leica公司）拍摄伤口，采用ImageJ 1.53a版图像处理软件（美国国立卫生研究院）并根据恢复面积百分比分析细胞迁移程度。迁移指数＝实验组迁移距离/对照组迁移距离。

1.5 免疫印迹检测

将A7r5接种在6孔板中，细胞达到70%～80%时用PDGF-BB和/或JuB处理各组细胞；用裂解缓冲液（上海碧云天生物技术公司）从细胞中提取蛋白质样品，提取液于4℃、12 000转离心20 min，取上清液，用二辛可酸（BCA）蛋白质分析试剂盒（上海碧云天生物技术公司）评估蛋白质样品浓度；按照标准规程处理获得等体积等量蛋白质样品；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）胶（10%分离胶）电泳后，样品中蛋白条带被分离，行聚偏二氟乙烯（PVDF）（美国Millipore公司）转膜；5%脱脂牛奶封闭膜上非特异性结合位点1 h，膜与一抗在摇床上4℃孵育12 h，所用一抗为小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）单抗（美国CST公司，1∶1 200稀释）、兔抗LC3B单抗（英国Abcam公司，1∶1 200稀释）；将膜与二抗在摇床上室温孵育1 h，所用二抗为抗兔二抗（上海碧云天生物技术公司，1∶1 500稀释）、抗小鼠二抗（上海冠泰生物科技公司，1∶40 000稀释）；洗膜5次后，用超敏显影液（南京诺唯赞生物科技公司）和化学发光成像系统曝光可视化所得目的条带，根据条带灰度值用ImageJ 1.53a版软件作半定量分析。β-微管蛋白（tubulin）作为内参。

1.6 统计学分析

实验数据获得至少通过3次独立重复实验。采用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析，数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JuB抑制PDGF-BB诱导的A7r5增殖

各浓度（0～100μmol/L）JuB预处理A7r5 24 h，再用PDGF-BB（25 ng/mL）刺激24 h，结果显示JuB呈浓度依赖性显著抑制PDGF-BB诱导的A7r5增殖；与正常对照组相比，25 ng/mL PDGF-BB处理后A7r5增殖能力显著增加，而5～100μmol/L JuB预处理显著降低PDGF-BB诱导的A7r5增殖能力，见图1。由于JuB在100μmol/L作用浓度时细胞活力低于正常对照组，后续选用10、25、50μmol/L JuB进行多剂量实验。免疫印迹法检测增殖标记物PCNA蛋白显示，PDGF-BB（25 ng/mL）显著诱导PCNA表达（P＜0.001）；与PDGF-BB组相比，JuB预处理呈浓度依赖性显著降低PCNA表达，见图2。

图1 不同浓度JuB对A7r5活力的影响

2.2 JuB减弱PDGF-BB诱导的A7r5细胞迁移

划痕愈伤实验结果显示，与正常对照组相比，PDGF-BB刺激24 h显著缩小划痕开口（P＜0.001）；相比于PDGF-BB刺激组，10、25、50μmol/L JuB预处理可呈剂量依赖性显著抑制PDGF-BB诱导的A7r5细胞迁移，见图3。

图2 各组A7r5 PCNA相对表达量

图3 24 h时各组A7r5细胞迁移情况（倒置显微镜，×50）

2.3 JuB逆转PDGF-BB诱导的A7r5细胞自噬

免疫印迹法检测自噬的分子标记物微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）B蛋白，结果显示A7r5细胞LC3B蛋白表达在PDGF-BB组显著高于正常对照组（P＜0.001），提示PDGF-BB激活A7r5细胞自噬；PDGF-BB+JuB组显著低于PDGF-BB组，表明JuB可抑制PDGF-BB诱导的A7r5细胞自噬，见图4。

3 讨论

新内膜增生是血管介入术后再狭窄的关键进程［14］。VSMC过度增殖和迁移在新内膜增生发生发展中起着关键作用，因此抑制VSMC异常增殖和迁移对预防再狭窄具有重要意义。PDGF-BB是从受损血管释放出的最有效促分裂原之一，在促进VSMC增殖中起重要作用［6］。本研究选择PDGF-BB作为体外刺激剂建立细胞模型并用JuB进行干预，观察JuB对VSMC增殖和迁移能力的影响。

图4 各组A7r5细胞LC3B蛋白相对表达量

有研究表明JuB具有抗肿瘤作用，然而其是否可抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移尚未见报道。本研究通过CCK-8检测A7r5细胞活性间接反应细胞增殖情况，免疫印迹实验检测到增殖标记物PCNA被JuB下调，并用划痕愈伤实验检测JuB对VSMC迁移调节作用，首次发现JuB可能是一种能有效阻止PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移的药物。

为进一步探究JuB对VSMC增殖和迁移的抑制机制，本研究检测自噬标记物LC3蛋白表达水平。细胞处于能量匮乏、应激状态时，可通过上调自噬分解更多蛋白质，从而提供细胞存活需要的能 量［15］。已有文献 报 道，PDGF-BB可诱 导 自 噬［16］。自噬激活可促进细胞增殖、迁移［17］。本研究通过免疫印迹检测显示，JuB可显著抑制PDGF刺激的A7r5细胞LC3B蛋白表达，因此JuB可能通过抑制自噬发挥对VSMC增殖和迁移的抑制作用。

综上所述，本研究结果显示JuB可抑制VSMC异常增殖和迁移，机制上可能与其抑制PDGF-BB诱导的VSMC自噬有关，提示对血管介入术后新内膜增生引起的再狭窄具有治疗作用。更为具体的生物学机制有待进一步深入研究。