殷聚辉， 郭 静,2， 王 艳,2， 曹 政， 管福成,2， 刘树兴

(1. 大连工业大学 纺织与材料工程学院， 辽宁 大连 116034；2. 辽宁省功能纤维及复合材料工程技术中心， 辽宁 大连 116034)

因糖尿病、外伤和手术灼伤而导致的皮肤缺损是常见现象。直径1 cm以上的伤口或全层缺损需要植皮，以防止形成更严重的疤痕及由此导致的外观毁损和功能障碍[1]。自体移植数量有限和自然资源供量不足使相关治疗受限，而人工组织支架材料的应用为患者的康复提供了更大的可能。

海藻酸钠因具有良好的生物相容性[2]和生物降解性、低毒性及成膜性[3]成为伤口愈合、软骨修复、药物输送等方面的优选材料[4-6]，但单一海藻酸钠制备的组织支架材料存在脆性大、强度低、耐水性差等[7]问题，因此对其改性受到了越来越多的关注。在众多改性方法中，利用海藻酸钠的聚阴离子性质与具有阳离子特性的大分子，如纤维蛋白[8]、丝素蛋白和透明质酸[9]，构筑聚电解质复合体系可有效改善支架材料的强度和生物相容性。其中，质量分数的改变会极大影响到材料的各项性能。文献[10]分析了海藻含量变化对藻酸盐胶囊物理性质的影响发现，增加海藻酸钠浓度会使其直径和收缩率增大。陈娜丽等[11]以海藻酸钠(SA)为软模板，采用原位氧化聚合法制备了聚苯胺/海藻酸钠(PANI/SA)电极材料，研究发现PANI/SA的比电容随SA质量分数的增加先升高后降低。由此可见，溶液质量分数对材料的性能有显著的影响。南极磷虾产量巨大，且富含与人体相似的蛋白质源[12]，经稀碱提取的磷虾蛋白(AKP)在弱碱性环境中具有阳离子特性，将其与海藻酸钠共混可明显提高纤维的力学性能[13]，改善耐水性。本文研究在前期工作基础[14-15]上，使用低温诱导相分离-化学交联法制备了SA/AKP支架材料，并研究了不同质量分数对支架材料的微观结构和性能、细胞毒性等方面的影响。

1 实验部分

1.1 原 料

南极磷虾粉：粒径200～1 000 μm，含水率15%，辽宁渔业集团有限公司；海藻酸钠，相对分子质量为3×106～5×106，青岛明月海藻集团有限公司；氯化钠、氢氧化钠、二水氯化钙、盐酸，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水氯化钙，分析纯，西陇化工股份有限公司；L929成纤细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8，合肥新恩源生物技术有限公司；75%乙醇，铁岭康泰消毒剂有限公司；PBS，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 AKP提取与SA/AKP支架材料的制备

先配制质量分数为2%的氢氧化钠溶液，升温到40 ℃，按浴比为1∶30加入南极磷虾粉，搅拌并升温到70 ℃，恒温处理2 h，降温到常温，过滤，除去不溶物，向滤液中加入盐酸调节pH值到等电点，过滤，取滤饼，室温风干，得到南极磷虾蛋白AKP，其相对分子质量约20 000(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法)。

将AKP用质量分数为0.5%的NaOH溶液溶解，调节溶液pH值至7，然后加入SA，搅拌直至完全溶解，配成质量分数为3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%的SA/AKP溶液，其中SA与AKP质量比为5∶1。将制备的溶液静置脱泡，使用刮膜机刮膜、预冷冻、冷冻干燥、氯化钙凝固浴交联，水洗和干燥后制成SA/AKP支架材料，制备工艺流程见图1。

图1 SA/AKP支架的制备过程Fig.1 Schematic diagram of preparation of SA/AKP scaffold

1.3 测试与表征

1.3.1 表面形貌观察

采用JSM-7800F型扫描电子显微镜(SEM，日本电子公司)观察SA/AKP支架的断面形貌，加速电压为10 kV。SA/AKP支架平均孔径和孔径分布通过Nano Measurer软件和高斯拟合进行统计学计算。

1.3.2 化学结构测试

采用Spectrum-One B型红外光谱仪(FT-IR，美国PE公司)分析SA/AKP支架材料的化学结构。将SA/AKP支架材料粉碎，用KBr 压片制样，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.3 孔隙率与透气性测试

孔隙率：使用液体置换法测量SA/AKP支架孔隙率[16]。

透气性：称量瓶中称取适量去离子水，用不同质量分数SA/AKP的样品密封瓶口，分别标为D1、D2、D3、D4、D5，以未放置样品的称量瓶为对照组，标号D0，在干燥器中避光放置24 h，透气率公式[17]为

式中：R为样品透气率；Dn为n号样品24 h失水量，g；D0为对照组24 h失水量，g。

1.3.4 液体吸收性

使用容量瓶配置质量分数为0.9%的氯化钠溶液作为生理盐水备用；仿人体血清由氯化钠和氯化钙的溶液组成，溶液含142 mmol钠离子和2.5 mmol的钙离子，此含量与人体血清相当。剪取2 cm×2 cm 样品，置于干燥器中恒温干燥24 h，称量W0，再将样品分别置于生理盐水、仿人体血清、去离子水中12 h，用吸水纸轻拭将表面水分吸干后称量W1。吸液率K通过下式求得：

1.3.5 力学性能测试

将SA/AKP支架材料剪切成长为40 mm、宽为5 mm 的样条，每个系列抽取10个样品，用YG004型电子单纤维强力机(常州市第一纺织设备有限公司)测试支架断裂强度。其中，拉伸速度为20 mm/min， 夹具间隙为30 mm。断裂强度、断裂伸长率通过下式可得：

图2 不同质量分数SA/AKP支架的SEM照片Fig.2 SEM image of different mass fraction SA/AKP scaffold

式中：P为断裂强度，N/mm2；F为断裂强力，N；S为横截面积，mm2；E为断裂伸长率,%；L0为样品初始长度，mm；L为断裂时的长度，mm。

1.3.6 细胞毒性测试

采用浸提液法对支架材料进行毒性测试，将SA/AKP支架材料用75%乙醇浸洗5 min，然后用磷酸缓冲溶液PBS浸洗5 min，反复3次后加入纯培养基直至没过材料，静置24 h后作为浸提液备用。在96孔板中接种L929成纤细胞悬液，在潮湿的培养箱中预培养24 h(37 ℃、5%CO2)，更换细胞培养液，然后加入10 μL先前制备好的SA/AKP支架材料浸提液，不加浸提液的为空白组。将培养板在细胞培养箱中培养12～48 h。取出L929细胞培养板，向板的每个孔中加入110 μL CCK-8培养基混合液，将细胞板在培养箱中孵育30 min后取出，使用酶标仪在450 nm波长条件下测定各孔吸光度，取平均值并通过对照组评定材料的细胞毒性，以细胞的增殖度为标准(见表1)划分安全等级[18]。

表1 细胞增殖率与毒性水平的对应关系Tab.1 Correspondence between cell proliferation rate and cytotoxicity level

2 实验结果和讨论

2.1 SA/AKP支架材料形态结构分析

不同质量分数SA/AKP支架的SEM照片、孔径分布分别如图2、3所示。

从图可看到：SA/AKP支架材料具有致密微孔结构，在SA/AKP溶液质量分数为3.0%和3.5%时，微孔大小形状相对杂乱，孔径大小差异较大；溶液质量分数为4.0%时，微孔大小均一，平均孔径为54.11 μm，形状规整；溶液质量分数增加到4.5%以后，溶液质量分数过大，出现粘连，孔隙结构被破坏。据文献[19]报道，细胞最适宜生长的孔径为20～125 μm，质量分数为4.0%时的SA/AKP支架孔径大小适合人体细胞生长，为本研究提供了前提条件。

图3 不同质量分数SA/AKP支架的孔径分布图Fig.3 Pore size distribution image of different mass fraction SA/AKP scaffold

2.2 SA/AKP支架材料的化学结构分析

SA和AKP以及SA/AKP支架的FT-IR光谱如图4所示。从图可看出：AKP在1 657 cm-1(酰胺Ⅰ谱带)与1 533 cm-1(酰胺Ⅱ谱带)处出现了蛋白质的特征吸收峰；SA在1 420 cm-1(COO-对称伸缩振动)与1 632 cm-1(不对称伸缩振动)处，2 922 cm-1(—CH伸缩振动)与3 408 cm-1(—OH伸缩振动)处出现明显特征吸收峰。而SA/AKP支架未出现新峰，但羟基、氨基特征峰向右偏移至3 435 cm-1处。

图4 SA和AKP以及SA/AKP支架的FT-IR光谱Fig.4 FT-IR spectra of SA and AKP and SA/AKP scaffold

这是因为海藻酸钠COO-与Ca2+产生螯合作用，使得OH…O类型氢键减少，成键电子云密度升高而导致羟基峰右移。图中1 632和1 420 cm-1处COO-不对称伸缩振动和对称伸缩振动峰位置向低波束移动到1 615 cm-1和1 417 cm-1处。这说明SA与AKP支架在引入Ca2+之后，Ca2+与COO-产生了多重交联反应，即Ca2+与COO-发生螯合作用，同时Ca2+与AKP中含有的COO-反应生成凝胶，正是这种作用提高了支架材料的强度和耐水性。

2.3 SA/AKP支架材料孔隙率与透气率分析

不同质量分数SA/AKP支架的孔隙率和透气率如图5所示。

图5 不同质量分数SA/AKP支架的孔隙率和透气率Fig.5 Porosity and air permeability of different mass fraction SA/AKP scaffold

从图可看出，随SA/AKP溶液质量分数的增加，支架材料的孔隙率和透气率逐渐降低。这是因为随着SA/AKP溶液质量分数增加，SA/AKP体系内有效分子数增多，分子之间作用增强，水含量减少，预冻形成冰晶数量降低，导致孔隙率下降，而透气率也因为孔隙率下降而下降。海藻酸钠在二价阳离子作用下会发生胶凝反应，主要是古洛糖醛酸片段的Na+与二价Ca2+发生离子交换，形成四配位基型“蛋盒”结构，稳定了支架材料的孔隙结构，使其具有较好的孔隙率和透气率。SA/AKP支架的透气性模型如图6所示。水分子和氧气等通过相互连接的孔洞进出支架，实现了物质的运输。溶液质量分数为4%时, SA/AKP支架孔隙率为86.4%，透气率为58.9%，满足了支架材料的需求[20]。具备良好孔隙率和透气率的支架可促进成纤细胞的生长，给皮下组织提供生长所需氧气和排出废气，并保持适当的环境潮湿度，从而有利于表皮组织的生长，是制备组织工程支架的重要前提。

图6 SA/AKP支架的透气性模型Fig.6 Mechanism diagram of air permeability of SA/AKP scaffold

2.4 液体吸收性分析

对于烧伤、烫伤、溃疡等伤口，一般会有脓液流出，所以支架应该具有良好的液体吸收性。不同质量分数SA/AKP支架的吸液率如图7所示。

图7 不同质量分数SA/AKP支架的吸液率Fig.7 Liquid absorbency of different mass fraction SA/AKP scaffold

可看出，随溶液中SA/AKP质量分数的上升，SA/AKP支架对仿人体血清、生理盐水、去离子水的液体吸收性逐渐降低。首先这是因为随溶液中SA/AKP质量分数的增加，材料孔隙率下降导致吸水率降低，其次是因为多重网络结构的形成导致闭孔或微小孔，限制了水分子的进入，液体吸收模型如图8所示，被吸收的液体储存在支架材料的孔洞结构中。当SA/AKP溶液质量分数为4.0%时，SA/AKP支架对仿人体血清、生理盐水、去离子水的吸收率分别为1 661.2%、 1 539.0%、 1 283.2%，满足支架对液体吸收性要求。

图8 SA/AKP支架的吸液模型Fig.8 Mechanism diagram of liquid absorption of SA/AKP scaffold

2.5 力学性能分析

不同质量分数SA/AKP支架的力学性能如图9所示。

图9 不同质量分数SA/AKP支架的力学性能Fig.9 Mechanical properties of different different mass fraction SA/AKP scaffold

由图可看到，随溶液中SA/AKP质量分数的增加，支架的断裂强度呈现不断上升的趋势。这是因为随SA/AKP溶液质量分数的增加，体系交联点增多，相同界面上承受应力的有效面积增加，故断裂强度和断裂伸长率均增加。当溶液中SA/AKP质量分数为4.0%时，断裂强度达到15.5 MPa，断裂伸长率达到6.6%。结合支架孔洞结构和吸液性认为，SA/AKP溶液质量分数为4.0%时最优。

2.6 细胞毒性分析

图10示出采用CCK-8法检测不同质量分数的SA/AKP材料浸提液对成纤细胞增殖的影响。结合表1细胞增殖率与毒性水平的对应关系发现，不同质量分数SA/AKP支架浸提液的细胞相对增殖率均大于100%，毒性水平为0级，不具有细胞毒性。毒性测试表明，材料对细胞增殖，分化有一定的促进作用。因此可认为，这种材料具有优异的细胞相容性和生物安全性，可作为医用材料使用。

图10 不同质量分数SA/AKP支架的细胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of different mass fraction of SA/AKP scaffolds

3 结 论

本文利用低温诱导相分离-化学交联法制备了海藻酸钠/磷虾蛋白(SA/AKP)支架材料，并探讨了支架材料的形貌结构、孔隙率、力学性能及生物相容性。结果表明：SA/AKP支架材料的孔隙率和透气率随SA/AKP质量分数增加呈现减少的趋势；对仿人体血清、生理盐水、去离子水的吸收性随SA/AKP质量分数增加而减少；材料的断裂强度与断裂伸长率随SA/AKP质量分数增加而增加。不同SA/AKP质量分数的支架的浸提液的分级均大于90%，毒性为0级。在SA/AKP质量分数为4.0%时，SA/AKP支架材料的孔径大小在20～96 μm之间，孔径大小均一，形状规整；透气率为58.9%，孔隙率为86.4%，满足了支架材料的需求；对仿人体血清、生理盐水、去离子水吸收率分别为 1 661.2%、 1 539.0%、 1 283.2%； 断裂应力和断裂伸长率分别达到15.5 MPa、6.6%；毒性为0级，材料具有优异的细胞相容性和生物安全性。本文研究为SA/AKP组织工程支架提供了基础数据，为新型组织支架材料的应用提供了一种新思路。