刘晨霞， 常 凯， 那琬琳， 王艳艳， 牟 东， 李 华， 江忠勇， 刘 媛， 熊 杰

1 西南医科大学 临床医学院， 四川 泸州 646000； 2 西部战区总医院 a.检验科， b.消化科， c.肿瘤科， 成都 610083

1 材料与方法

1.1 样本收集 收集2010年—2017年西部战区总医院HCC切除术后5年预后良好肝癌组织(n=6)和手术后2年内复发患者的肝癌组织(n=6)。患者排除糖尿病、冠心病、高血脂、高血压、肾病和自身免疫性疾病。患者第1次肝癌切除术中肝癌组织置于保护液放入液氮中保存。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质提取 将待测样品置于裂解缓冲液中，冰浴超声匀浆器处理，收集上清液备用[8]。

1.2.2 蛋白质消化和TMT标记 使用Thermo Scientific 的BCA蛋白测定试剂盒及TMT蛋白标记试剂盒，根据说明书消化酶切标记合成肽混合物于室温2 h，标记好的样本进行真空干燥备用。

1.2.3 HPLC-MS/MS分析 在缓冲液(20 mmol/L甲酸铵水溶液)中溶解肽混合物，Ultimate 3000高效液相系统(Thermo Fisher scientific, MA, USA)进行分离。流动相为5%～45%线性梯度，20 mmol/L甲酸钠(溶剂：80%乙腈)，流速1 ml/min，分离12个馏分。

肽段分馏组分用含0.1%甲酸的超纯水分别溶解，10 μl样品上样过色谱柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18, 100 μm×2 cm)，流速10 μl/min。随后线性梯度2%～40% D液(含0.1%甲酸的乙腈)分别经分析柱(Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm)70 min，流速300 nl/min。

1.2.4 靶基因分析 在数据库miRbase和NCBI中收集各物种已知成熟的has-miR-152-3p序列，应用VectorNTI对该序列在各物种之间进行同源性分析[9]。采用TargetScan、picTar、microT、PITA、miRmap和miRanda 6个在线数据库预测has-miR-152-3p的靶基因及转录因子。

1.2.5 生物信息学分析 采用Gene Ontology(GO)和DAVID数据库对has-miR-152-3p预测的靶基因集合进行富集分析和基于REACTOME数据库的信号转导通路富集分析。应用GAD disease和OMIM disease两个疾病数据库进行疾病富集；应用CGAP EST QUARTILE进行组织富集分析；应用BIOGRID INTERACTION进行蛋白互作分析。以P<0.05为显著性阈值，得到基因集合相对于背景具有统计学意义的信号转导和疾病通路[10]。

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1.2.6 突变率分析及生存曲线分析 应用TCAG数据库和GDC数据库，采用群组分析研究方法调取与肝脏组织有关目的基因的所有基因突变和生存率分析相关数据10 202例，以AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1基因为筛选条件，共发现有关研究项目153例。逐一下载相关研究序列信息，分析其单群组单基因生存曲线、突变类型和突变频率；再分析多群组多基因联合的生存曲线、突变类型和突变频率。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由西部战区总医院伦理委员会审批，所纳入患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 靶基因预测与GO分析 应用TargetScan、picTar、PITA、miRmap、microT和miRanda 6个数据库抓取的靶基因分别为655、413、2522、1304、1128和1035个。应用媒介严格控制方法(CLIP数据≥2)筛选得到3714个靶基因。

将>2个数据库预测得到的3174个候选靶基因进行GO分析，发现miR-152-3p的靶基因主要富集在核质、细胞质和细胞溶质等区域(P<0.01)。分子功能主要富集在蛋白结合、ATP结合、细胞黏附等分子功能中(P<0.01)。涉及细胞间黏着、细胞周期停滞、细胞黏附调节等主要生物学进程(P<0.01)(表1)。将GO富集分析后的生物学对应事件进行比例分析如图1[11]。

注：a，GO生物学进程分布图；b，GO分子功能分布图；c，GO细胞成分分布图。

2.2 TMT标记定量蛋白质组学检测与分析 应用RT-PCR检测经HCC切除术后5年预后良好和手术后2年内复发患者肝癌组织的miR-152-3p表达水平。RT-PCR检测表明肝癌复发组的miR-152-3p相对表达量(0.047±0.022)明显低于预后良好组(0.231±0.154，t=5.973，P<0.001)。应用TMT技术标记肝癌组织后经LC-MS/MS检测分析获得肽段42 029个，结合miR-152-3p候选靶基因分析得到显著性差异表达蛋白质17个，其中ROBO1、MCM3、MET、MRPL28、SHC1、TMTC3、STAU1、FOXRED1、MMS19、BCCIP、MTMR12、AKAP1、MRPL50在术后复发组中蛋白质表达量降低；而CAP1、HLA-C、RTN4、SLC44A2蛋白质表达量升高(P值均<0.05)(图2)。

图2 TMT全蛋白组学定量检测分析miR-152-3p靶蛋白质的表达差异

2.3 靶基因GO富集分析 将TMT蛋白测序得到的17个受miR-152-3p调控的靶基因进行GO分析，发现靶基因主要富集在线粒体和质膜区域。分子功能主要富集在Poly(A)RNA结合和蛋白质结合等分子功能中。涉及线粒体翻译延伸/终止和信号转导两大生物学进程(表1)。

表1 miR-152-3p靶蛋白的GO富集分析结果

2.4 靶基因的相关代谢通路富集分析 基于REACTOME pathway方法对miR-152-3p靶基因进行富集分析。ROBO1和CAP基因参与Slit/Robo信号通路；MRPL28和MRPL50参与线粒体翻译的起始、终止和延伸途径。信号通路均与癌症复发机制关系密切(表2)。

表2 miR-152-3p靶蛋白的相关信号通路富集分析结果

2.5 靶基因的相关疾病富集分析 基于GAD disease和OMIM disease两个疾病数据库，对miR-152-3p靶基因进行富集分析[12]。结果显示蛋白质定量性状位点富集分值最高；其次为获得性免疫缺陷综合征、头颈癌和乳腺癌(表3)。

表3 miR-152-3p靶基因的相关疾病富集分析结果

2.6 靶基因的组织定位富集分析 SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1 5个基因富集在正常胎盘组织中；ROBO1、SLC44A2等基因富集在正常结肠组织；CAP1、HLA-C等基因富集在正常脾组织中(表4)。然而正常胎盘组织表达的基因在肝癌组织中出现，说明SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1基因具有促进激活细胞增殖、分裂等能力，与肿瘤的增殖复发关系密切。

表4 miR-152-3p靶蛋白的组织定位富集分析结果

2.7 靶基因的多重富集分析及验证 多重富集分析发现miR-152-3p靶基因主要作用于肝癌细胞的线粒体呼吸链，参与蛋白为AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1，其可能的调控模式如图3。

图3 miR-152-3p靶蛋白参与呼吸链调控的预测途径

基因突变及突变后生存曲线分析结果表明：上述蛋白的功能缺失或减弱会严重影响患者的预后生存率。SHC1和AKAP1的体细胞突变频率较高，均为3.33%，STAU1在该组队研究中未发现体细胞突变。SHC1和AKAP1发生拷贝数变异增加的频率也相对较高，分别为48.68%和17.11%。发生拷贝数变异减少频率较高的基因是FOXRED1，为16.45%(表5)。临床生存率分析研究表明：SHC1基因突变后的5年生存率为22%，线粒体呼吸链相关6个基因多群组研究分析其5年生存率为41%。无论单基因群组研究，还是多基因群组分析均表明，线粒体呼吸链相关的6个基因功能发生改变时均会严重影响生存率(图4)。

图4 miR-152-3p作用于线粒体呼吸链相关基因的突变率及生存曲线分析

表5 miR-152-3p作用于线粒体呼吸链相关基因的突变频率统计表

3 讨论

已有研究发现miR-152-3p在HCC中的表达程度较低，表明miR-152-3p可能在肝癌的发生和进展中具有抑制肿瘤的能力[12-13]。Dang等[14]发现miR-152-3p的下调程度与HCC的临床分期有关。晚期Ⅲ、Ⅳ期患者miR-152-3p表达明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P值均<0.05)。肿瘤体积越大，miR-152-3p的表达越低，表现为肿瘤的生长和恶化[15]。因此，已有的研究结果揭示了miR-152-3p与肝癌进展的关系紧密，检测miR-152-3p的表达对临床预测HCC的进展和预后具有重要价值，然而其具体的调控机制、信号通路及作用位点并不明确。

该研究中发现miR-152-3p靶基因主要作用在线体呼吸链中，参与调控的靶蛋白AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1在肝癌复发组中均不同程度降低。但已有研究表明在肿瘤分化与增殖过程中线粒体呼吸链的活跃程度增高，上述6个呼吸链相关蛋白在肝癌组织中的表达量均高于癌旁组织。肿瘤干细胞是肿瘤细胞中存在的小部分具有无限自我更新和多向分化潜能的细胞亚群，是肿瘤复发、恶性转移的细胞学根源。肿瘤干细胞时刻维持较低的细胞氧化代谢水平，待到时机成熟进行大量的增殖分化。因此，笔者认为在肝癌复发组中呼吸链相关蛋白表达量较低从某种程度上反映了肿瘤干细胞的比例较高，肝癌复发的可能性较大。

在受miR-152-3p调控的靶蛋白中，FOXRED1作为呼吸链NADH脱氢酶的装配因子，可调节呼吸链复合体Ⅰ的功能，进而影响包括诱导肿瘤发生和mtDNA突变所致的损伤[16]；AKAP1是重要的线粒体调节蛋白，对线粒体氧化呼吸和活性氧自由基的生成有增强作用[17]；MRPLs(MRPL50/L28)是合成线粒体核糖体大亚基的成员，影响下游线粒体蛋白的翻译和呼吸链复合体的合成[18]。SHC1和STAU1可与HSP70相互作用抑制凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)从线粒体的释放，AIF作为双功能蛋白酶，具有氧化还原活性和促进凋亡活性[19]。AIF作为氧化还原酶，是呼吸链复合体的直接构成元件，还是仅影响呼吸链复合体 Ⅰ 的组装及其稳定性仍有待进一步研究[20]。这6个蛋白与线粒体呼吸链的结构构成、氧化分解和能量释放直接相关，是肝癌细胞线粒体氧化呼吸的重要调控因子。本研究中分析的基因突变率和生存曲线也反映出这6个基因对细胞及生物个体的影响。

综上，miR-152-3p主要通过调控靶基因AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1作用于线粒体呼吸链，影响细胞氧化呼吸功能导致HCC复发。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：刘晨霞、常凯、江忠勇负责课题设计、资料分析、撰写论文；那琬琳、王艳艳、牟东、李华参与收集数据、修改论文；刘媛、熊杰负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。