赵金金， 张海光， 崔非非， 汪 磊， 莫清江， 焦路阳

新乡医学院第一附属医院 a.检验科, b.妇产科， 河南 新乡 453100

肝癌在我国一直是高发性肿瘤，其致死率位居第二，仅次于肺癌[1]。干细胞具有无限增殖和多向发育的特性[2]，肿瘤干细胞具有干细胞的特性,且在肿瘤的发生发展及药物耐受方面发挥重要作用[3]，目前靶向肿瘤干细胞的肿瘤治疗已经成为研究的新热点。CD133是一种细胞表面糖蛋白，与多种癌症(包括脑、前列腺、肝癌、胰腺和结肠癌)中的肿瘤干细胞相关[4-5]。

肿瘤由于生长迅速局部通常呈现出缺氧状态，此时缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)1α高表达[4]。HIF-1α对肿瘤的增殖、迁移都发挥着重要的作用[6]，同时研究[7]显示耐药的肿瘤细胞其HIF-1α的表达水平显著高于非耐药细胞。缺氧时HIF-1α促进肿瘤细胞高表达CD133，以提高干细胞的比例从而使其对化疗药物耐受，这一机制已在神经胶质瘤和乳腺癌中得到证实[4-5]。但是，HIF-1α在肝细胞癌耐受化疗药物方面的研究较少，HIF-1α能否通过诱导肝癌干细胞增强其对化疗药物的耐受仍未知，因此本研究拟探讨HIF-1α对肝癌细胞HepG2干细胞特性及其对表阿霉素耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂与仪器 人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库，培养于5% CO2、37 ℃培养箱中，DMEM高糖培养液购自Gibco，胎牛血清购自杭州四季青，LipoFiterTM3.0 转染试剂购自汉恒生物科技有限公司，人CD133抗体购自BioLegend，凋亡试剂盒购自eBioscience，MTT、表阿霉素购自Sigma。HIF-1α抗体购自CST，HRP标记的二抗购自Proteintech，超敏型ECL发光液购自Millipore。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HepG2采用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养于5% CO2、37 ℃培养箱中，细胞生长至90%密合度时消化细胞铺板进行实验。

1.2.2 细胞转染 细胞生长至90%密合度时细化铺6孔板，每孔1×106细胞，第2天使用LipoFiterTM3.0试剂按照说明书对细胞进行转染。实验分为3组：不转染质粒的HepG2组，转染空质粒pcDNA3.0的对照组及转染HIF-1α质粒的实验组。

1.2.3 实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法检测HIF-1α基因表达 细胞转染后48 h，吸弃培养液，每孔中加入1 ml TRIzol试剂(Invitrogen)按照说明书提取总RNA并测定RNA浓度，用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gNDA Eraser(TaKaRa)进行反转录；将所得cDNA用TB GreenTMPrimix Ex TaqTMⅡ(TaKARa)试剂盒按照说明书进行荧光定量PCR；所用引物为HIF-1：上游引物，CCACAGGACAGTACAGGATG，下游引物，TCAAGTCGTGCTGAATAATACC；GAPDH：上游引物，GTCAACGGATTTGGTCGTATT，下游引物，ATCACTGCCACCCAGAAGACT。

1.2.4 Western Blot检测HIF-1α表达 转染后48 h，PBS清洗细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，BCA法测浓度后加入5×loading buffer，SDS-PAGE电泳90 min，将蛋白条带转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，HIF-1α抗体1∶1000稀释后覆膜过夜，第2天TBST洗膜5次，加入二抗孵育1 h，加ECL发光液后于凝胶成像系统(Amersham Imager 600，美国GE)下拍照。

1.2.5 流式细胞术检测CD133表达 取HepG2组、对照组、实验组细胞各1×106个，PBS洗涤后加入含有CD133抗体的PBS 100 μl，避光染色20 min，PBS洗涤后流式细胞仪进行检测。

1.2.6 MTT法检测细胞活性 3组细胞消化计数后铺96孔板，每孔1×104个细胞，第2天加入0、 6.25、 12.5、 25、 50 μmol/L的表阿霉素作用24 h后，加入20 μl 0.5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后，吸弃培养基加入200 μl DMSO，孵育10 min后测定A490。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 3组细胞消化计数后铺6孔板，每孔1×106个细胞，第2天加入50 μmol/L的表阿霉素作用48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入AnnexinV-FITC抗体染色20 min，PBS洗涤后加入5 μl PI，流式细胞仪收集细胞并分析。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由新乡医学院第一附属医院伦理委员会审批，批号：2020255。

2 结果

2.1 HIF-1α成功转染至HepG2细胞 real-time qPCR结果显示，对照组与HepG2组相比HIF-1α mRNA表达水平无差异，实验组HIF-1α的表达水平明显高于HepG2组和对照组(P值均<0.001);Western Blot结果显示，HepG2组和对照组HIF-1α蛋白基本不表达，实验组HIF-1α高表达(图1)。

注： a，real-time qPCR检测HIF-1α质粒在HepG2细胞的表达；b，Western Blot检测HIF-1α质粒在HepG2细胞的表达。

2.2 3组细胞CD133表达的比较 流式细胞术检测显示，HepG2组及对照组细胞表面CD133阳性率分别为0.040% ± 0.003%和0.030%±0.010% ，实验组CD133的阳性率(20.110%±0.600%)明显高于HepG2组及对照组(P值均<0.001)(图2)。

图2 流式细胞术检测HepG2细胞CD133表达

2.3 表阿霉素对3组细胞活性的影响 不同浓度的表阿霉素作用于3种细胞24 h后细胞活性如表1所示。低剂量的表阿霉素(6.25、12.5 μmol/L)对细胞活性影响不大，且3组细胞间差异无统计学意义(P值均>0.05)；高剂量的表阿霉素(25、50 μmol/L)能够显著抑制HepG2组及对照组的细胞活性，但是对实验组细胞活性影响不大，实验组细胞活性均显著高于对照组和HepG2组(P值均<0.05)。

表1 不同浓度表阿霉素作用24 h的细胞活性

2.4 表阿霉素处理后3组细胞凋亡比较 50 μmol/L的表阿霉素作用于3组细胞48 h后，HepG2组及对照组的细胞凋亡比例分别为93.6%±1.5%和93.0%±1.2%，实验组的细胞凋亡比例(67.9%±2.5%)较HepG2组及对照组明显降低(P值均<0.001)(图3)。

图3 流式细胞术检测细胞凋亡情况

3 讨论

HIF-1α是细胞内重要的转录因子，在正常状态下细胞表达的HIF-1α分子很快的通过泛素-溶酶体途径被降解[8-9]。当细胞处于应激状态，特别是缺氧时HIF-1α能够避免降解从而发挥多种生物学功能[10]。已有研究[4-5]证明HIF-1α与肿瘤细胞的能量代谢、内皮间充质转化、对化疗药物的耐受等过程息息相关。但是HIF-1α诱导肿瘤细胞耐药的具体机制仍不清楚。

肿瘤干细胞被认为是肿瘤中一类能够自我更新，维持肿瘤生长的细胞群[3]。目前公认的肿瘤干细胞标志物有CD133、CD44、CD24等[11]。肿瘤干细胞对化疗药物具有耐受性已经得到共识。缺氧时HIF-1α可以诱导Sox2、Oct4等干细胞标志物的表达[12]，这些蛋白进一步调控CD133的表达，因此CD133被认为是新的干细胞标志物。在神经胶质瘤和乳腺癌中HIF-1α诱导的CD133表达同化疗药物耐受已经得到证实，并有研究[4-5]阐述了其具体机制。

表阿霉素是治疗肝细胞癌的常用化疗药物，其可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡进而起到抑制肿瘤发展的作用[13-14]。然而肿瘤细胞对表阿霉素的耐药性通常使其疗效降低。笔者前期研究[15]结果显示，HIF-1α高表达时肝癌细胞的干细胞比例和对表阿霉素的耐药性同时增加，这表明HIF-1α提高了肿瘤细胞干细胞特性并且促进其对化疗药物耐药。通常确定肿瘤干细胞的方法有软琼脂实验、克隆形成实验、小鼠成瘤实验以及干细胞标志物的检测等[16]。本研究仅检测了一种干细胞标志物，实验结果虽略显单薄，但也证明了干细胞比例的增加。

干细胞比例增加与表阿霉素耐受性的关系在本实验中并未得到充分的证实，后期将对高表达HIF-1α的肝癌细胞进行CD133分子的敲低，进一步研究HIF-1α、CD133与耐药性的关系。

本研究中选用了CD133作为肝癌干细胞的标志物，流式细胞术显示过表达HIF-1α后CD133的阳性率显著增加。细胞活力实验和凋亡实验均显示HIF-1α能够降低肝癌细胞对表阿霉素的敏感性。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：赵金金负责课题设计，资料分析，撰写论文；张海光负责实验操作，参与数据分析；崔非非、汪磊参与实验操作；莫清江参与收集数据，修改论文；焦路阳负责拟定写作思路，指导撰写论文并最后定稿。