许凯伦 蒋倩倩 郑伊诺 徐汇镔 陆荣茂 周朝生 胡园

摘要 [目的]通过固相萃取，建立超高效液相色谱-串联质谱法同时分析水体及水产品中6种喹诺酮类药物残留检测方法。[方法]水质检测方法取样量少，生物检测方法利用乙腈和水作为提取液，并添加DMSO，增进目标物在乙腈中的溶解度从而提高回收率;调查浙江省某地区20个中华鳖养殖场养殖水体和中华鳖的6种喹诺酮药物残留水平。[结果]水质检出2种喹诺酮残留，检出浓度最大值分别为421.06 ng/L（恩诺沙星）、54.20 ng/L（环丙沙星）;中华鳖样品中检出4种喹诺酮残留，最大检出浓度分别为3.98 μg/kg（氧氟沙星）、3.22 μg/kg（培氟沙星）、127.44 μg/kg（恩诺沙星）、65.00 μg/kg（环丙沙星），食品安全指数均值为0.000 7，食品安全状态较好。[结论]该方法灵敏度较高、分析时间较短、回收率较高，可以定量检测养殖水体和养殖生物体中喹诺酮类药物残留。

关键词 喹诺酮;养殖水体;中华鳖;药物残留;食品安全指数;固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号 TS254.7 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）01-0181-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.049

Abstract [Objective]A method for simultaneous detection of 6 kinds of quinolone in environmental water samples and aquatic products samples by using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed.[Method]The volume of water sample which was needed was small，and aquatic products samples were extracted with the mixture of acetonitrile， water and DMSO. The residue of 6 kinds of quinolone antibiotics in water in aquafarm and Trionyx sinensis in an area of Zhejiang Province was measured.[Result]2 antibiotics were detected in water samples with maximum concentrations of 421.06 ng/L（enrofloxacin），54.20 ng/L（ciprofloxacin）.4 antibiotics were detected in Trionyx sinensis with maximum concentrations of 3.98 μg/kg（ofloxacin），3.22 μg/kg （pefloxacin），127.44 μg/kg（enrofloxacin），65.00 μg/kg（ciprofloxacin）. The average number of IFS of Trionyx sinensis was 0.000 7， which was acceptable. [Conclusion]This method has high sensitivity， short analysis time and high recovery rate， and can quantitatively detect quinolone drug residues in aquaculture water and aquaculture organisms.

Key words Quinolone;Aquaculture water;Trionyx sinensis;Drug residues;IFS;Solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

抗生素能有效预防和治疗疾病，并有一定的促进生长的作用，被广泛地用于医药、畜禽水产的养殖业中。我国作为人口大国和养殖业大国，抗生素使用量巨大。2013年中国科学院广州地球化学研究所发布了全国抗生素污染地图，調查估算一年有超过5万t抗生素排放进水土环境中，其中46.1%由养殖业引起[1]，浙江属于较为严重的抗生物污染地区。

喹诺酮是一类人工合成的广谱类抗菌药，通过抑制细菌的DNA解旋酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ）和拓扑异构酶Ⅳ（topoisomerase Ⅳ）而影响细菌的DNA复制、转录、修复和细胞壁的染色体分裂过程，从而使细菌失活，对革兰氏阳性菌等菌株有良好的抗菌效果，是现阶段大量使用的一类抗生素[2-3]。由于其具有服用吸收好、抗菌谱广、半衰期较长、价格相对低廉等突出优势，在包括中国以内的许多国家和地区，喹诺酮已经成为在水产养殖方面最常用的药物之一。虽然喹诺酮药物在细菌耐药性和多重耐药性问题上，从第1代到第4代上有了很大的改善，其使用安全性也随着药效动力学和细胞毒性等方面的改良而显著提高[4]，但是随着水产行业集约化发展、高密度养殖，各种细菌性和真菌性等鱼病频发，渔民违规、超量、滥用喹诺酮药物，因其施药后，仅少部分被机体吸收，大部分喹诺酮被排泄到水体，或沉降到沉积物中，仍会引发细菌耐药性不断增强的问题，也对环境造成污染，最终影响人体健康[5]。

目前，市场上流通的药品以氟喹诺酮类抗生素为主，如环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星等，随着对氟喹诺酮类药物在环境和生物体中残留和风险评估等研究不断深入，不少药物已经逐步被我国和其他国家归为兽用禁药。我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》（农业部公告第193号）、《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部公告第235号）、《农业部决定在食品动物中停止使用洛美沙星等4种兽药》（农业部公告第2292号）等文件中对诺氟沙星等药物和物质作出了规定。因此该研究建立了养殖水体和养殖水产品中6种最常见的喹诺酮药物超高效液相色谱-质谱联用检测分析方法，有助于进一步分析浙江省养殖水体、养殖中华鳖以及其他水产品喹诺酮的含量和分布情况，并检测分析了浙江省某地区中华鳖养殖场养殖水体和中华鳖的喹诺酮残留。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters Xevo TQ-S 三重四级杆质谱仪、氮吹仪。

恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）、培氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星，纯度≥95%（Dr.Ehrenstorfer）;Oasis HLB 固相萃取小柱（ 500 mg/6 mL），购于美国Waters 公司;甲醇、乙腈为色谱纯，购于上海安谱公司。

1.2 样品采集 2019年9—12月采集浙江省某地区20个中华鳖养殖场水质样品20个，20个中华鳖样品。样品于24 h内带回实验室处理，水质样品经0.45 μm滤膜过滤备用，中华鳖取其肌肉组织均质备用。

1.3 样品前处理

1.3.1 水样提取。水样经0.45 μm滤膜过滤后，量取40.0 mL，加入10.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液混合均匀，以1～2滴/s的速度过HLB固相萃取柱（不需要活化），待试样完全流出后，用3.0 mL去离子水淋洗，减压抽干，用6.0 mL甲醇溶液洗脱。将洗脱液在40 ℃下，氮吹浓缩至近干，用1.00 mL 10%的甲醇水溶液溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤，待上机测定分析。

1.3.2 生物样提取。称取1.0 g（精确到0.01 g）中华鳖样品至50 mL塑料离心管，加入2.0 mL H2O，再加入8.0 mL含2%DMSO的乙腈水溶液，振荡提取5 min，在4 ℃下5 000 r/min离心5 min，取其上清液。

1.3.3 净化。取3.0 mL提取液，于15 mL离心管中，加入3.0 mL乙腈溶液，混合均匀，4 ℃下5 000 r/min离心5 min。以1～2滴/s的速度过HLB固相萃取柱（不需要活化），弃去初始2.0 mL流出液体，收集剩余流出液于另一干净15 mL离心管，氮吹浓缩至近干，用纯水定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤，待上机测定分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件。

色谱柱为waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温40 ℃;进样量3.0 μL;流速0.25 mL/min;流动相为甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）;洗脱程序为0～0.3 min，10%A;0.3～3.5 min，10%～70%A;3.5～3.7 min，70%A;3.7～4.0 min，70%～10%A;4.0～6.0 min，10%A。

1.4.2 质谱条件。离子源：电喷雾离子源;柱温：40 ℃;通过多反应监测（MRM）进行数据采集，离子模式：ES+，毛细管电压为1.5 kV，离子源温度150 ℃，去溶剂气温度600 ℃;去溶剂流速：1 000 L/h;锥孔流速：0.15 mL/min。6种喹诺酮类质谱参数如表1所示。

1.5 食品安全指数（IFS）

IFS远小于1时，表明该物质对食品安全没有影响;IFS≤1，表明该物质对食品安全的风险是可以接受的;IFS>1，表明该物质对食品安全影响的风险超过了可以接受的限度，需要进入风险管理[6-7]。

IFS=R×FSI×bw

其中，IFS为食品安全指数;R为药物残留浓度（μg/kg）;F为食品消费量（kg/d）;SI为安全摄入量，用ADI代入计算;

bw为体重，取60 kg计算。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

尽管乙腈作为流动相的有机相部分，系统压力比甲醇低，但是大多数化合物在甲醇中获得比在乙腈中更强的响应，而且甲醇毒性比乙腈小，故流动相有机相部分选择甲醇。

对比流动相水相部分添加甲酸、乙酸铵和不添加3种情况， 0.1%甲酸峰型效果好。

如图1、2，流动相分别为甲醇和0.1%甲酸水溶液、乙腈和0.1%甲酸水溶液、甲酸和去离子水、乙腈和去离子水。图1中总离子图中流动相为甲醇和0.1%甲酸水溶液、乙腈和0.1%甲酸水溶液的峰型较好，但是在图2中单个组分上，流动相有机相为甲醇的峰型更好，基线更平稳，而且乙腈为流动相，有杂峰。所以选择流动相为甲醇和0.1%甲酸水溶液。

2.2 前处理条件优化

為水质样品获得较高的回收率，考察了甲醇、乙腈、丙酮3种洗脱剂对0.1、0.5和1.0 μg/L的加标浓度水平下6种喹诺酮药品回收率的影响。结果显示，乙腈、丙酮洗脱6种药物在3种不同加标浓度下的回收率较低，而甲醇洗脱3种不同加标浓度的样品回收率在61%～120%，故选择甲醇作为水质样品的洗脱剂。

生物样提取中第一步中用含有DMSO的乙腈水溶液，是因为多数兽药为极性化合物或弱极性化合物，增加了样品中水含量，而DMSO具有增加多种兽药在乙腈中溶解度的作用，以提高回收率[8]。提取液合并后，其有机相比例为80%，尽管大部分蛋白质和脂肪被分离，提取液中还是存在水溶性基质和盐分，取3.0 mL提取液，加入3.0 mL乙腈溶液混合均匀，将有机相比例提升至90%，剩余大部分的水溶性基质和盐分通过离心沉淀，因为蛋白质、盐分等在高浓度的乙腈中溶解度显著降低。

2.3 样品加标回收率

水质样品以外标法进行测定，取空白样品40 mL，添加3个不同浓度水平的混合标准溶液配制成0.1、0.5和1.0 μg/L的浓度，生物体取空白样品1 g，用内标法加入10和20 ng混合标准品，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD）。结果发现（表2），水质样品中6种喹诺酮的加标回收率为61.4%～120.6%，RSD为1.2%～16.9%;生物体中6种喹诺酮的加标回收率为73.3%～113.7%，RSD为0.8%～7.6%。

2.4 工作曲线线性范围和方法检出限 按“2.1”优化的色谱条件进样，6种喹诺酮药物在0.5～10.0 μg/L具有良好的线性关系，其相关系数（r）均大于0.99。以信噪比（S/N）≥10对应浓度为依据估算仪器的检出限，结果发现（表2），水质样品和生物体中6种喹诺酮的检出限分别为0.6～9.1 ng/L、0.04～0.71 μg/kg。

2.5 实际样品中喹诺酮的含量 该试验中于浙江省某地20个中华鳖养殖场采集的20个水质样品和20个中华鳖样品，用所建立的分析方法进行目标喹诺酮的分析。结果显示，部分水样中检出恩诺沙星、环丙沙星，其中2批次检出恩诺沙星，检出浓度为0.27～10.50 μg/L，1批次检出环丙沙星，检出浓度为1.36 μg/L;部分中华鳖样品中检出氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和培氟沙星，其中6批次检出氧氟沙星，检出浓度在0.79～3.98 μg/kg，1批次检出培氟沙星，检出浓度为3.22 μg/kg，7批次检出恩诺沙星，检出浓度为1.70～127.44 μg/kg，8批次检出环丙沙星，检出浓度为1.87～65.00 μg/kg。

3 讨论

3.1 水质样品中喹诺酮药物的残留状况

结果显示，浙江省该地区20个中华鳖养殖场水体喹诺酮残留不太严重。与其他研究相比，李佩佩等[9]检测温州和舟山的10个养殖厂水体，一批次检出环丙沙星，检出浓度为0.01 μg/L;赵东豪等[10]检测广东省水产养殖场养殖水10份，其中3份水样检出了恩诺沙星、环丙沙星，检出浓度为117～376 ng/L，情况比较一致。养殖场水质样品中检出率不高，可能是因为在喹诺酮类药物在水体中转移能力较强，会随着时间推移，沉降富集到底层沉积物上，同时养殖场会定时换水，部分药物残留经水体交换排放出去。

3.2 中华鳖样品中喹诺酮药物的残留状况

浙江省该地区20个中华鳖养殖场采集的中华鳖样品检出率较高，目前，市场上水产品喹诺酮类药物检出情况也比较多。2020年浙江省市场监督管理局公布的2020年第7期食品安全监督抽检信息通告中，4批次的大黄鱼和黑鱼中氧氟沙星不合格[11]。2019年12月，温州市市场监督管理局开展的日常食品安全监督抽检有关情况通报中，检出黑鱼氧氟沙星23.9 μg/kg，花螺恩诺沙星和环丙沙星总和233.0 μg/kg[12]。

根据农业部第235号公告，恩诺沙星的每日允许摄取量（acceptable daily intake，ADI）为2 μg/kg[13]，由于恩诺沙星在生物体内会转化成环丙沙星，按其总量计算。据不完全统计，2013年浙江省甲鱼销售量约为11.2万t[14]，浙江省人口约为5 500万人，估算得平均每人每天消费5.58 g。该试验中，恩诺沙星和环丙沙星之和浓度为0～192.44 μg/kg，均值为15.55 μg/kg，则食品安全指数（IFS）均值为0.000 7，最大值为0.008 9，远低于1。其他4种喹诺酮没有设定ADI值，不予计算。

4 结论

（1）该试验中，水质检测方法取样量少，生物检测方法利用乙腈和水作为提取液，并添加了DMSO，增进了目标物在乙腈中的溶解度从而提高回收率，而且两者其净化过程简单方便。该方法灵敏度较高、分析时间较短、回收率较高，可以定量检测养殖水体和养殖生物体中喹诺酮类药物残留，为进一步监测浙江省典型养殖环境中水体喹诺酮类物质分布以及分析生物体喹诺酮类物质残留聚集和代谢提供技术支持。

（2）该试验中20份水样和20份中华鳖样品的6种喹诺酮药物残留结果表明，养殖水中，喹诺酮类药物不容易富集。中华鳖中检出率较高，IFS远小于1，其食品安全状态可以接受。但是采用的消费量水平数据，是根据全省消费量和人口数据计算，数据有一定的局限性和误差性。特定地区单一食品膳食摄入量的缺失，是当前制约食品风险评估的主要瓶颈问题。因此，开展特定地区膳食摄入量调查，对该地区开展食品安全评价有重要意义。

参考文献

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[10]赵东豪，王强，王旭峰，等.超高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖水体中49种兽药的残留量[J].中国渔业质量与标准，2017，7（3）：30-37.

[11]沐夕.浙江这7批次样品检出不合格 涉及食品农兽药残留、污染物超标问题[EB/OL].（2020-02-20）[2020-02-21].https：//www.sohu.com/a/374502137_172731.

[12]温州市市场监督管理局：16批次食品抽检不合格[EB/OL].（2019-12-05）[2020-02-21].http：//www.cqn.com.cn/ms/content/2019-12/05/content_7866309.htm.

[13]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部第235号公告：动物性食品中兽药最高残留限量[EB/OL].（2002-12-24）[2020-02-21].http：//jiuban.moa.gov.cn/zwllm/nybz/200803/t20080304_1028649.htm.

[14]赵春光.浙江省甲鱼产业发展现状和前景[J].科学养鱼，2015（1）：1-2.