鞠娜，张文风，翁丽丽

（长春中医药大学基础医学院，吉林长春130117）

玉液汤出自张锡纯的《医学衷中参西录》，由生黄芪15g、葛根4.5 g、生山药30g、知母18 g、五味子9g、生鸡内金3.5 g和天花粉9 g组成，为治疗气阴两虚消渴的名方。张锡纯[1]提出消渴多由元气不升所致，认为中焦气化失司，气不生津及大气下陷均能导致消渴的发生，故创玉液汤以补气升举、生津止渴、滋阴润燥。张文风[2]临床治疗消渴应用玉液汤及玉液汤化裁，收效甚佳；玉液汤加减方临床效果明显，能有效改善气阴两虚型消渴病患者的临床症状以及血糖指标，对患者预后具有重要作用；玉液汤加减能够提高Ⅱ型糖尿病患者胰岛B细胞功能[3]；动物实验证实玉液汤能有效降低糖尿病大鼠的血糖、血脂和糖化血红蛋白等指标的水平[4]。为使玉液汤能够标准化生产，更广泛地应用于临床，故对玉液汤水煎提取工艺进行考察，筛选最佳提取工艺[5-10]。

1 仪器与设备

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司e2695型，配置Empower工作站）、光电二极管阵列检测器PDA（美国Waters公司2998型）、减压干燥箱（上海越众仪器设备有限公司）、HH-S2数显恒温水浴锅、AUW120D分析天平（岛津制造所）、FA1004B电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、FST-Ⅲ-20S普力菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 材料与试剂

中药材生黄芪、葛根、知母、五味子、生鸡内金、生山药和天花粉均采购于安徽道源堂中药饮片有限公司；葛根素对照品（规格20 mg，批号S02M9B54875，纯度98 %，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇等分析试剂均为分析纯；水为屈臣氏水。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计

将影响玉液汤提取效果的主要因素加水量设为A（8倍量、10倍量和12倍量），煎煮次数设为B（1次、2次和3次），煎煮时间设为C（60 min、90 min和120 min），采用L9（34）正交实验优选玉液汤的最佳提取工艺。在平行操作条件下，每次实验均按处方量称取生黄芪、葛根、知母、五味子、生鸡内金、生山药和天花粉等药材，按单因素实验所筛选出的最佳浸泡时间、吸水量，加水浸泡，并按下列因素水平进行水煎煮提取，收集提取液，滤过，合并滤液浓缩至稠膏，减压干燥得干膏粉。因素水平设计见表1。

表1 玉液汤提取工艺因素水平表Table 1 Factors and levels in Yuye Decoction extraction process

2.2 葛根素含量测定[11，12]

2.2.1 色谱条件色谱柱为Agilent TC-C18（250 mm 4.6 mm，5m）；流动相为甲醇-水（25：75）；检测波长为250 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品适量，以30%乙醇为溶剂，制备成20g/mL的葛根素溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备取干膏粉（过4号筛）0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，称定重量，加热回流15 min，于室温下放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备取不加葛根饮片制得的干膏粉0.3 g，并按2.2.3项下的制备方法制备，即得。

将对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，分别按2.2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1、图2和图3。

图1对照品溶液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference solution

图2供试品溶液HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of test solution

图3阴性样品溶液HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of negative sample solution

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系实验 精密吸取葛根素对照品溶液1份，分别以2L、4L、6L、8L、10L、12L、16L和20L的进样量按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定并记录峰面积。以进样量X（g）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=6546387.92x 17633.38，R为0.9999，结果表明，葛根素在0.04～0.4g范围内与峰面积的线性关系良好。

2.2.5.3 重复性实验取同一因素水平条件下制备得干膏粉，平行制备6份供试品溶液，精密吸取10L，按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量，结果得玉液汤干膏粉中葛根素平均含量为0.44%，RSD为1.94%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.2.5.5 加样回收率实验精密量取已知含量样品干膏粉0.15 g，共6份，分别精密加入0.011 4 mg/mL的葛根素对照品溶液50 mL，称定重量，加热回流15 min，于室温下放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，再按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 葛根素得加样回收率Table 2 Sample recovery rate of puerarin （n=6）

2.3 数据分析及结果验证

2.3.1 数据分析

正交实验结果见表3，方差分析见表4。以干膏得率和葛根素转移率为指标进行综合评分，由表3和表4可知，3个因素的影响大小依次为B＞A＞C，A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，其中因素B对提取工艺影响的差异具有统计学意义。本着节约能源、绿色生产的原则，综合分析3个因素对玉液汤干膏得率和葛根素转移率的影响，最佳提取工艺为A2B3C2，即加水量为10倍量，提取次数为3次，提取时间为每次90 min。

表3 玉液汤正交实验结果Table 3 Orthogonal experimental results of Yuye Decoction

表4 玉液汤提取工艺方差分析Table 4 Analysis of variance of Yuyetang extraction process

2.3.2 工艺验证

为了验证所选条件的合理性与正确性，按照优选出的最佳提取工艺进行3次验证实验，结果得葛根素平均转移率为60.04%，平均干膏得率为18.93%，说明此提取工艺合理、可靠且稳定，验证结果见表5。

表5 验证实验测定结果Table 5 Verification test results

3 讨论

玉液汤出自经典书籍，临床应用及实验研究均显示其治疗消渴安全有效。该方以黄芪与葛根为主药，药效物质基础研究以葛根素、黄芪甲苷或黄芪多糖为主，无论在复方配伍中还是单味药的现代药理研究中，黄芪甲苷与葛根素都是公认的降糖指标成分[13-15]。本实验以葛根素为指标考察玉液汤提取工艺。葛根具有生津止渴的功效，《神农本草经》载葛根“主消渴”，目前临床多以葛根为主配伍益气养阴清热之品治疗消渴[16]。药理学研究表明，葛根能通过改善胰岛素抵抗、保护胰岛B细胞和促进糖代谢等多种途径治疗糖尿病[17]；葛根素能够明显降低Ⅱ型糖尿病大鼠的体重、血脂和血糖水平[18]。研究发现，黄芪、葛根混煎时，黄芪比重大，葛根素的溶出率较高，而葛根比重大，葛根素的溶出率无显著变化甚至变小[19]；黄芪、葛根配伍时，黄芪可有效提高葛根素在大鼠体内的生物利用度[20]，表明配伍黄芪可以增强葛根的效用以及葛根素的溶出度，尽可能溶解和浸出有效成分，是在提取工艺层面上确保中药汤剂疗效高低的重要因素，故以葛根素含量为提取工艺的考察指标，更能说明玉液汤有效成分提取得完全与否。

遵循古意，本实验以水为提取溶剂，采用煎煮法进行提取。影响提取工艺的因素共有3个，分别为加水倍数、煎煮次数与煎煮时间，且因素间有交互作用，实验工作量大，实施困难，故选择高效、经济的L9(34)正交试验设计实验。预试验结果显示，加2倍水浸泡90 min可使药材充分浸泡达到吸水饱和。在实验过程中，以葛根素为指标，发现干燥温度对葛根素损失影响较大，当温度高于70℃时，葛根素损失率较大，且温度越高损失率越大；但温度低于65℃时，干燥十分困难，故本试验选择65～70℃进行减压干燥。减压干燥具有温度低、速度快、减少药物与空气接触的时间及降低药物污染率等一系列优点，同时考察了不同提取方式、不同提取时间以及不同提取溶剂等对葛根素含量的影响，根据实验结果选择30%乙醇作为提取溶剂，加热回流15 min制备供试品溶液。

综合考察因素和实验结果，以葛根素为考察指标的玉液汤最佳工艺体系是加10倍量水，煎煮3次，每次90 min，且此提取工艺经验证合理可行。经该工艺提取得到的葛根素转移率为60.04%，干膏得率为18.93%，说明此提取工艺合理、可靠且稳定，从葛根素转移率角度验证了该提取工艺使玉液汤得以发挥最大的临床疗效。经优选出的最佳提取工艺为玉液汤的剂型研究奠定基础，可为其工业化生产提供科学依据。