赵佳雯，张 亮，周 頔, 王志刚，杨心怡，文 明*

(1.重庆医科大学附属第一医院放射科，重庆 400016；2.重庆医科大学附属第二医院超声科，重庆 400010)

卵巢癌是女性死于生殖系统恶性肿瘤的主要病因[1]，化学治疗(简称化疗)仍为临床常用，但存在严重药物毒副作用[2]，药物对肿瘤的低选择性及肿瘤耐药性是主要因素[3]。光热治疗(photothermal therapy, PTT)可利用近红外激光照射产生热量杀灭肿瘤细胞，提高药物对肿瘤组织细胞的渗透性，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[4]；但其产热分布不均可致肿瘤消融不彻底，引起复发和转移[5]。本研究拟制备聚乳酸羟基乙酸共聚物聚乙二醇叶酸[poly(lactic co glycolic acid)-poly(ethylene glycol) -folic acid, PLGA-PEG-FA]包裹硫化铋(bismuth sulfide, Bi2S3)、阿霉素(doxorubicin hydrochloride, DOX)及全氟己烷(perfluoropentance, PFP)的叶酸靶向相变型纳米粒(FBS-PFP-PLGA@DOX)，用于CT/超声/光声多模态显像及可视化引导下光热联合体外治疗卵巢癌。

1 材料与方法

1.1 材料 DOX(美仑生物技术有限公司)，Bi2S3、PLGA-PEG-FA(西安瑞禧生物科技有限公司)，全氟己烷PFP(Strem Chemicals)，二氯甲烷(CH2Cl2)，异丙醇，聚乙烯醇(PVA，美国Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，上海Sigma-Vetec公司)。

1.2 仪器 声振仪(XL2020，美国Heat System)，磁力搅拌器(GL-3250C，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，电子分析天平(XS104，上海精密科学仪器有限公司)，低温离心机(Centrifuge 5804 R，德国Eppendorf)，倒置荧光显微镜(IX53，日本Olympus)，激光粒径及电位测量仪(Zetasizer Nano ZS90，美国Malvern)，紫外分光光度计(UV2600，日本Shimadzu)，电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma massspectrometry, ICP-MS)，透射电镜(H7500,日本Hitachi)，激光共聚焦显微镜(德国Leica)，酶标仪(ELX800，美国伯腾)，808 nm激光仪(西安中川光电科技有限公司)，光声成像仪(Vevo© LAZR，加拿大Visual Sonics公司)；Esaote MyLab 90超声成像仪，GE 64排螺旋CT。

1.3 制备FBS-PFP-PLGA@DOX纳米粒 采用双乳化法[6]，称取50 mg PLGA-PEG-FA溶于3 ml CH2Cl2，再加入200 μl Bi2S3及400 μl PFP溶液，充分混匀后加入含10 mg DOX的水溶液200 μl，冰浴避光条件下声振3 min后加入4% PVA溶液8 ml进行二次声振，再加入2%异丙醇溶液10 ml，以磁力搅拌2 h至有机溶剂完全挥发，以双蒸水洗涤离心2次(10 000 r/min，4℃，5 min)，获得FBS-PFP-PLGA@DOX。同法分别制备FA-PFP-PLGA及BS-PFP-PLGA@DOX，4℃保存。

1.4 观察FBS-PFP-PLGA@DOX基本特征 以光镜及透射电镜观察FBS-PFP-PLGA@DOX形态，以激光仪测量其粒径及平均电位，紫外分光光度计和电感耦合等离子质谱分别测量DOX和Bi2S3包封率和载药量。

1.5 细胞寻靶实验 选择对数期生长的卵巢癌SKOV-3细胞，以1×105个/孔密度接种于共聚焦皿中，孵育24 h。实验分为靶向组及非靶向组，分别加入100 μl红色荧光染料DiI标记的FBS-PFP-PLGA@DOX及BS-PFP-PLGA@DOX。继续孵育3 h后加入10 μl蓝色荧光染料DAPI染色15 min，再以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤。将共聚焦皿置于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。

1.6 体外多模态显像

1.6.1 CT 配置不同浓度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)FBS-PFP-PLGA@DOX溶液进行CT扫描。扫描参数：管电压80 kV，管电流170 mA，层厚0.625 mm。采用Horos软件测量各EP管中溶液CT值。

1.6.2 光声显像 将不同浓度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)FBS-PFP-PLGA@DOX溶液加入凝胶模型中，置于光声成像仪上，以一定波长激光辐照各组样品，采集各组样品的光声图，并利用仪器自带软件测量光声信号强度。

1.6.3 超声 将FBS-PFP-PLGA@DOX配置为不同浓度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)，加入1 ml凝胶模型中，以808 nm近红外激光(1 W/cm2)辐照5 min后用进行超声扫查，采集FBS-PFP-PLGA@DOX相变前后二维声像图及造影模式图像，以DFY定量分析软件测量回声强度变化。

1.7 光热成像及光致相变实验 ①将FBS-PFP-PLGA@DOX稀释为不同浓度(0、2、4、6、8、10 mg/ml)加于96孔板内，用808 nm近红外激光(1 W/cm2)辐照5 min并记录其温度变化。②光热稳定性实验，将100 μl的10 mg/ml FBS-PFP-PLGA@DOX加入96孔板，以808 nm近红外激光辐照5 min后关闭激光，待温度降至室温后再度开启激光，进行5个循环，全程记录温度变化。③FBS-PFP-PLGA@DOX光致相变实验，将FBS-PFP-PLGA@DOX稀释后滴加于载玻片上，放于倒置荧光显微镜，开启激光辐照，记录其辐照前后变化情况。

1.8 细胞毒性实验 选择处于对数生长期的SKOV-3细胞，以1×104个/孔密度接种于96孔板内，孵育24 h。实验分为7组：①对照组；②激光辐照组；③FA-PFP-PLGA(100 μl，1 mg/ml)+激光辐照组(808 nm，5 min)；④BS-PFP-PLGA@DOX组(100 μl，1 mg/ml)；⑤BS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)+激光辐照组(808 nm，5 min)；⑥FBS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)；⑦FBS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)+激光辐照组(808 nm，5 min)。每组设3个复孔，加入100 μl细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)溶液后继续孵育1 h，以酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度。

1.9 统计学分析 采用SPSS 18.0统计分析软件。计量资料以±s表示，两两比较采用t检验；生存率两两比较采用t检验，两变量之间关系采用线性相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FBS-PFP-PLGA@DOX基本性能 制备的FBS-PFP-PLGA@DOX呈球形，透射电镜可见其具有壳核结构(图1A)，Bi2S3分布于PLGA外壳上(图1B)；经Malvern激光粒径仪检测，平均粒径为(255.00±90.82)nm(图1C)，Zeta电位为(-7.07±4.33)mV(图1D)；紫外分光光度计测得DOX标曲(R2=0.994)，DOX的包封率为(26.77±0.46)%，载药量为(2.34±0.04)%；ICP-MS测得Bi2S3的包封率为(87.57±0.12)%，载药量为(3.38±0.01)%。

图1 FBS-PFP-PLGA@DOX表征 A、B.透射电镜图； C.粒径分布图； D.Zeta电位图

2.2 细胞寻靶实验 激光共聚焦显微镜见DiI标记的纳米粒呈红色，DAPI标记的SKOV-3细胞核呈蓝色。靶向组中红染FBS-PFP-PLGA@DOX特异性结合于蓝染SKOV-3细胞周围；非靶向组未见二者明显结合(图2)。

图2 激光共聚焦显微镜观察靶向纳米粒寻靶能力 A.蓝色荧光染料DAPI标记的SKOV-3细胞； B.红色荧光染料DiI标记的FBS-PFP-PLGA@DOX； C.靶向组纳米粒寻靶情况； D.蓝色荧光染料DAPI标记SKOV-3细胞； E.红色荧光染料DiI标记的BS-PFP-PLGA@DOX； F.非靶向组纳米粒寻靶情况

2.3 体外多模态显像

2.3.1 CT FBS-PFP-PLGA@DOX的CT图像对比度明显高于对照组，随Bi2S3浓度增加，FBS-PFP-PLGA@DOX CT图像对比度逐渐增高，对应CT值呈上升趋势(图3A、3E)。

图3 FBS-PFP-PLGA@DOX联合显像 A.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX的CT图(从左到右浓度依次为0、1、2、3、4、5 mg/ml)； B.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX的光声图(从左到右浓度依次为0、1、2、3、4、5 mg/ml)； C.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX的B-mode超声声像图(从左到右浓度依次为0、1、2、3、4、5 mg/ml)； D.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX超声造影图像(从左到右浓度依次为0、1、2、3、4、5 mg/ml )； E.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX的CT值； F.不同浓度FBS -PFP-PLGA@DOX的光声值； G.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX的B-mode模式超声回声强度值； H.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX超声造影模式回声强度值

2.3.2 光声显像 FBS-PFP-PLGA@DOX光声信号强度高于对照组，随Bi2S3浓度增加，FBS-PFP-PLGA@DOX光声信号逐渐增强，对应光声值也呈上升趋势(图3B、3F)。

2.3.3 超声 激光辐照后，随FBS-PFP-PLGA@DOX纳米粒浓度增加， B-mode与造影模式下回声强度均逐渐增加(图3C、3D、3G、3H)。FBS-PFP-PLGA@DOX超声回声强度随纳米粒浓度增高而增加。

2.4 光热成像及光致相 变 激光照射后，不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX快速升温，150 s后逐渐趋于稳定，且上升速度与纳米粒浓度呈正相关；对照组照射5 min始终未见温度上升(图4A)。激光开-关循环中，FBS-PFP-PLGA@DOX最高温度未见明显下降(图4B)。

图4 FBS-PFP-PLGA@DOX光热成像及光致相变实验 A.不同浓度FBS-PFP-PLGA@DOX激光辐照升温图； B.FBS-PFP-PLGA@DOX激光开/关5个周期温度曲线； C.FBS-PFP-PLGA@DOX激光照射前光镜图； D.FBS-PFP-PLGA@DOX激光照射后光镜图

光致相变实验中，激光照射前，显微镜下FBS-PFP-PLGA@DOX未见明显变化(图4C)；激光照射后，FBS-PFP-PLGA@DOX发生液-气相变，体积明显增大(图4D)。

2.5 细胞毒性实验 FBS-PFP-PLGA@DOX+激光组SKOV-3细胞生存率最低(12.17%)，FBS-PFP-PLGA@DOX组细胞生存率(31.57%)较之稍高(t=24.27，P<0.01)；FBS-PFP-PLGA@DOX组细胞生存率(31.57%)较BS-PFP-PLGA@DOX组(86.03%)低(t=96.04，P<0.01)；FA-PFP-PLGA+激光组与单纯激光组细胞生存率差异无统计学意义(t=1.71，P>0.05)。

3 讨论

PLGA可通过水解作用分解为可代谢成分并通过柠檬酸循环从体内清除[7]，生物安全性较好[8]。本研究以PLGA为载体制备的纳米粒平均粒径为(255.00±90.82)nm，可利用肿瘤渗透和滞留效应穿过血管内皮间隙而实现肿瘤显像[9]。

将Bi2S3包裹于纳米粒中，可用于多模态显像。铋元素具有较强吸收X线能力，可明显提高CT对比度，同时具有低毒性、粒径小、循环时间长及表面可修饰等优点[10]。光声效应主要基于光吸收质将光能转化为热能。Bi2S3具有强光吸收属性及高光热转化效率，可吸收近红外波段激光能量，对靶区组织进行光声显像，是良好的光声显像剂[11]。FBS-PFP-PLGA@DOX包裹Bi2S3后，与周围组织声阻抗差异增大，在超声波作用下发生振动，产生强烈的背向散射信号，可增强超声显像效果。激光辐照后，FBS-PFP-PLGA@DOX包裹的PFP升温至沸点以上，可发生液气相变而变为微气泡，改变周围组织声环境而增强超声对比。

随着联合疗法问世，光热联合治疗肿瘤成为研究热点[12]。文献[13]报道，41～45℃的高温疗法可与化疗等传统疗法协同治疗肿瘤。本研究发现，浓度为8 mg/ml及10 mg/ml的FBS-PFP-PLGA@DOX在短时间激光照射后迅速升温至42℃以上并趋于稳定；对FBS-PFP-PLGA@DOX进行5次重复激光照射，最高温度未见明显下降，表明FBS-PFP-PLGA@DOX有良好的光热稳定性，可在体内循环利用。DOX是常用的抗肿瘤药物，但其弥散性会对肿瘤细胞与正常细胞同时造成伤害。上皮来源肿瘤细胞可高表达叶酸受体，而正常组织几乎不表达，故叶酸可作为特异靶向肿瘤组织的靶点。叶酸与肿瘤细胞上叶酸受体特异性结合，使包裹抗癌药物的纳米粒精准地大量到达肿瘤组织，增强抗肿瘤效果[14]。本研究制备的FBS-PFP-PLGA@DOX可通过叶酸-叶酸受体靶向机制，主动靶向高表达叶酸受体的SKOV-3细胞；与非靶向组比较，FBS-PFP-PLGA@DOX能更多聚集于肿瘤组织，为多模态显像和光热联合化学治疗卵巢癌提供保障。FBS-PFP-PLGA@DOX+激光组SKOV-3细胞存活率远低于无激光组及非靶向组，说明叶酸能特异性与肿瘤细胞结合，且光热联合化学治疗能更大程度地杀伤肿瘤细胞；而FA-PFP-PLGA+激光组、单纯激光组对肿瘤细胞杀伤能力较弱，提示叶酸靶具备良好生物安全性。

综上，本研究成功制备了FBS-PFP-PLGA@DOX，能主动靶向高表达叶酸受体的卵巢癌SKOV-3细胞，具备良好的体外多模态显像能力，并有望实现多种方法协同增效治疗卵巢癌，应用前景广阔。目前对于纳米粒在细胞内的作用机制尚不清楚，有待进一步探讨。