梁冬牛，陈 峰，郑 磊△

（1.山东省立第三医院，山东 济南 250031；2.华润山东医药有限公司，山东 济南 250031）

舒肝和胃丸由佛手、白芍、陈皮、醋香附、木香等13味中药组方，舒肝解郁、和胃止痛[1]1603，用于治疗肝胃不和、两胁胀满、胃脘疼痛、食欲不振、呃逆呕吐、大便失调[2]。方中，佛手疏肝理气、和胃止痛[1]178，陈皮理气健脾、燥湿化痰[1]191，白芍养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳[1]105。其质量标准收载于2015年版《中国药典（一部）》，以芍药苷含量作为质量控制指标。单一成分的含量作为该药的质量控制指标，不能有效控制组方中其他组分的质量水平，更不能有效控制产品质量[3-5]。单婷婷等[6]的研究仅对舒肝和胃丸中的挥发性成分进行控制，缺少对多种组分的综合评价。与传统高效液相色谱（HPLC）法相比，超高效液相色谱（UPLC）技术具有分析速度快、灵敏度高、节约流动相等优点[7-9]，尤其是用于分析多组分样品时可显著提高分析效率。该制剂中，佛手为君药，白芍和陈皮为臣药。本研究中以白芍、陈皮和佛手中的主要成分芍药苷、橙皮苷、柚皮苷、欧前胡素和佛手柑内酯为研究对象，建立测定其含量的固相萃取-超高效液相色谱（SPE-UPLC）法，以综合评价产品质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1290型超高效液相色谱仪[配有二极管阵列（DAD）检测器、自动进样器、柱温箱，BOND ELUT型固相萃取（SPE）柱（500 mg ∶3 mL），均购自美国 Agilent公司）]；XP205型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为十万分之一）；KQ-600DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为600 W，频率为40 kHz）；Milli-Q advantage A10型超纯水机（美国密理博公司）；HSE-24B型固相萃取装置（天津市恒奥科技公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号为110736-201943，含量为95.1%），橙皮苷对照品（批号为110721-201818，含量为96.2%），柚皮苷对照品（批号为110722-201815，含量为 91.7%），欧前胡素对照品（批号为 110826-201918，含量为99.0%），佛手柑内酯对照品（批号为520036-201401，含量为99.2%），均购自中国食品药品检定研究院；舒肝和胃丸（大蜜丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，规格为每丸6 g，批号分别为19013386，18011800，18011801，200202，200401）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；磷酸（优级纯，中国医药集团有限公司）；超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 SB-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流速：0.5 mL/min；检测波长：230 nm（芍药苷），283 nm（橙皮苷、柚皮苷），248 nm（欧前胡素、佛手柑内酯）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：甲醇（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时 10%A～40%A，10～15 min时 40%A～45%A，15～20 min时45%A ～100%A）。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取样品适量，研碎，取2.0 g，精密称定，用定量滤纸包好，置索氏提取器中，加甲醇100mL，采用索氏提取法提取1 h，蒸干提取液，残渣加甲醇1 mL溶解，加入预先活化的SPE柱，加水3 mL通过SPE柱，弃水，再用70%甲醇10 mL洗脱，收集洗脱液，置50 mL容量瓶中，并用甲醇定容，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液：取芍药苷对照品22.92 mg，橙皮苷对照品26.26 mg，柚皮苷对照品10.46 mg，欧前胡素对照品35.28 mg，佛手柑内酯对照品47.45 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备溶液；分别精密量取各对照品贮备溶液1 mL，置同一100mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按2015年版《中国药典（一部）》方法，取方中除白芍、陈皮、佛手的10味中药饮片，按样品制备方法制备不含白芍、陈皮、佛手的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2项下3种溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果各成分色谱峰峰形对称，且与相邻色谱峰分离度良好，阴性对照无干扰。采用UPLC仪自带的DAD检测器光谱学纯度检测功能，分别检测5种成分色谱峰的光谱学纯度，结果均在仪器给出的阈值范围内，表明5种待测成分色谱峰均为单一的色谱峰，无色谱峰重叠干扰。

线性关系考察：取对照品贮备溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分别置100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得各对照品标准系列溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以各对照品溶液的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表1。

精密度试验：精密量取同一对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，连续测定6次。结果见表1，表明仪器精密度良好。

1.芍药苷 2.橙皮苷 3.柚皮苷 4.欧前胡素 5.佛手柑内酯A.对照品溶液 B.阴性对照品溶液 C.供试品溶液图1 超高效液相色谱图1.paeoniflorin 2.hesperidin 3.naringin 4.imperatorin 5.bergaptenA.Reference solution B.Negative reference solution C.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

表1 线性关系、精密度、稳定性及重复性试验结果Tab.1 Results of linear relationship，precision，stability and repeatability tests of five components

稳定性试验：取样品（批号为19013386）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于 0，4，8，12，24 h 时进样，记录各成分色谱峰峰面积。结果见表1，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为19013386）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，记录各成分色谱峰峰面积，并计算含量。结果见表1，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为19013386）1.0 g，共 6份，精密称定，置索氏提取器中，分别精密加入对照品贮备溶液0.25 mL，依法制备供试品溶液，进样测定，计算5种待测成分的回收率。结果见表2。

耐用性试验：取2.2项下供试品溶液，分别考察不同型号高效液相色谱仪（Agilent 1290型和LC20A型）、色谱柱[Poroshell120SB-C18柱（100mm×4.6mm，2.7μm）和 Accucore C18柱（100 mm ×4.6 mm，2.6 μm）]、柱温（30 ℃，40 ℃和室温）和流速（0.45，0.50，0.55 mL/min）对检测结果的影响。结果在上述范围内改变色谱条件，各色谱峰分离度均良好，表明方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取样品适量，依法制备供试品溶液，分别进样测定2次，计算各成分含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

UHPLC技术具有灵敏度高、分离度好、分析周期短的优点，更适合于检测中药中多种成分。Poroshell 120 SB-C18柱为表面多孔型颗粒填料，即核-壳型填料，具有极窄的粒径分布和扩散路径，可减小涡流扩散，缩短传质路径和减弱传质阻力，柱效较高[10]，故色谱柱选用Poroshell 120 SB-C18柱。舒肝和胃丸中5种成分具有不同的紫外吸收特征，王桢旭[4]报道的芍药苷为230 nm，杨冰[11]报道的柚皮苷和橙皮苷为283 nm，彭春梅等[12]报道的欧前胡素为248 nm，王向锋等[13]报道的佛手柑内酯为248 nm。本研究中采用DAD检测器，扫描5种成分的紫外吸收曲线，发现5种成分分别于230，283，248 nm波长处具有较强紫外吸收，这与文献报道一致，故分别选用 230 nm（芍药苷）、283 nm（橙皮苷、柚皮苷）、248 nm（欧前胡素、佛手柑内酯）作为检测波长。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

3.2 提取方式选择

分别考察了索氏提取法、超声波提取法和加热回流提取法的提取效果。采用超声波提取法时，需使用甲醇150 mL，分3次提取，然后合并提取液，提取过程较复杂；采用加热回流提取法时，提取过程与索氏提取法相似，但提取回收率仅为90%，略低于索氏提取法，推测原因可能是采用加热回流提取法时，并不能将样品中的待测成分完全转移到提取液中；索氏提取法采用少量的提取溶剂即可将待测成分全部转移到提取溶剂中，提取效率较高[14]，故采用索氏提取法提取样品。舒肝和胃丸由13味中药组方，所含成分复杂，尤其是水溶性糖类成分对分离效果影响很大，且会严重损耗色谱柱的使用寿命，为了减少其他成分对待测成分的干扰，故采用SPE柱富集与静态吸附待测成分，然后用强极性溶剂解析，尽可能除去其他成分的干扰。分别考察了以50%，70%，90%甲醇作为洗脱液时的洗脱效果，结果采用10mL 70%甲醇可将待测成分完全洗脱，且干扰杂质较少，故选用10 mL 70%甲醇为洗脱液。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of content determination（mg/g，n=2）

3.3 方法评价

舒肝和胃丸为2015年版《中国药典（一部）》中收载的中成药制剂，临床用量较大，但药典和已发表的文献均采用单一成分含量作为其质量控制指标，未综合评价组方中的多种组分，存在较严重的缺陷。本研究中以白芍、陈皮和佛手为研究对象，采用UPLC方法测定5种成分的含量，可有效控制该制剂的质量，方法重复性好，结果准确，可为舒肝和胃丸的质量控制提供理论依据。