谢林林，赵玉粒，陈 辉，钟振东，刘益如，庞显伦

(1.西南医科大学附属中医医院经典中医诊疗中心，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院老年科，四川 泸州 646000；3.四川省人民医院检验科，四川 成都 610000；4.西南医科大学附属中医医院健康管理中心，四川 泸州 646000)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝关节软骨退行性变化和关节表面边缘形成新骨为主要特征的关节退行性疾病。KOA有多种危险因素，包括遗传易感性、性别、年龄和肥胖等，其中肥胖所致膝关节负荷增加是KOA的一项重要危险因素。关节过度负荷增加了关节软骨的机械磨损，负载异常也可诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达并抑制胶原蛋白的合成。关节的过度负载除了直接影响软骨基质的合成与降解外，也可诱导促炎因子白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。然而也有研究发现，肥胖所致的KOA不仅局限于承重的膝关节，还能够诱导肘关节与指关节的病变，因此关节过度负荷并不能完全解释KOA与肥胖之间的关系。

近几年的研究发现，肥胖导致的脂质代谢紊乱与KOA的发生密切相关。脂肪组织是机体的一种内分泌器官，参与各种脂肪因子和细胞因子的分泌，当脂质代谢紊乱时可促进全身性的低度炎症。大量的临床研究发现，针灸对KOA具有较好的疗效，但针灸治疗KOA的作用机制尚不完全清楚。因此，本研究通过观察温针灸、谢氏点穴及其联合应用对高脂饮食诱导的肥胖大鼠KOA与脂质代谢的影响，探讨温针灸和谢氏点穴治疗KOA的可能作用机制，为针灸治疗该病提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性健康SD大鼠50只，10周龄，体质量为(205±5)g，购自成都达硕实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK(川)2020-030；使用许可证号：SYXK(川)2019-189]，所有动物实验在该公司进行。 标准饲料适应性喂养1周后进行动物实验。

1.2 主要试剂与材料 IL-1β(ml037361)、TNF-α(ml002859)、MCP-1(ml002960)和VEGF(ml002862) ELISA检测试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；全自动生化分析仪(Au2700)：日本奥林巴斯；0.22 mm×0.25 mm太和牌针灸针(AN0004)：中国苏州；MMP-1(E-AB-60244)和MMP-2(E-AB-40111)兔抗鼠多克隆抗体：Santa Cruz。

2 方法

2.1 动物分组及高脂饮食诱导肥胖大鼠KOA模型的复制 将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、温针灸治疗组、谢氏点穴治疗组、温针灸+谢氏点穴治疗组，每组10只。模型组、温针灸治疗组、谢氏点穴治疗组和温针灸+谢氏点穴治疗组大鼠均给予高脂饮食喂养，脂肪占总焦耳数的65%；给予对照组大鼠普通饲料喂养，脂肪占总能量的10%。高脂饲料配方：0.5%胆汁盐，1%胆固醇，5%蔗糖，15%蛋黄粉，18%猪油，60.5%基础饲料。所有动物单笼饲养，自由进食进水，每两周测量1次体质量。饲养8周后，剔除高脂饲料喂养的各组中体质量低于对照组平均体质量20%的大鼠，剩余大鼠继续喂养高脂饮食，12周后进行针灸治疗。

2.2 针灸干预方法 温针灸治疗：温针以膝三针(犊鼻、梁丘、血海)为主穴，辅以足三里和三阴交。谢氏点穴治疗：以犊鼻、梁丘、血海为主穴，辅以阳陵泉和承山穴。温针灸+谢氏点穴治疗：以犊鼻、梁丘、血海为主穴，同时辅以足三里、三阴交、阳陵泉和承山四穴。针刺前，采用自制固定装置仰卧位固定大鼠，使膝关节呈45°弯曲，75%乙醇无菌操作后，采用0.22 mm×0.25 mm一次性针灸针，每穴刺入3～5 mm，得气后将艾粒置于针柄，从下端点燃艾粒，每穴每次灸2壮，燃尽起针，每天1次，连续治疗2周。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 血脂四项的检测 针灸治疗结束后2 d，禁食12 h后处死所有大鼠，股动脉采血，分离血清，使用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(total triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)与低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的含量。

2.3.2 膝关节滑液中细胞因子的检测 将大鼠处死后，沿膝关节正中纵行切开暴露出膝关节，沿髌骨上缘约向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，打开膝关节腔，用1 mL无菌PBS灌洗关节腔留取关节滑液，离心后取上清。采用ELISA检测试剂盒测定关节滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和VEGF的含量。

2.3.3 番红O/固绿染色与Mankin评分 剥离大鼠皮肤肌肉，将右侧膝关节从股骨髁上1 cm至胫骨平台下1 cm完整取下，剔除肌肉组织。膝关节依次进行固定、脱钙、脱水、包埋、制片和番红O/固绿染色，封片后观察膝关节病变，并参照Mankin评分标准对软骨组织病变进行评估。软骨组织结构评分标准：正常，计0分；表面不平整，计1分；血管翳及表层破坏，计2分；裂隙达移行层，计3分；裂隙达辐射层，计4分；裂隙达钙化层，计5分；全层软骨缺失，计6分。软骨细胞数量评分标准：正常，计0分；增多或排列紊乱，计1分；成簇状，计2分；减少，计3分。潮线评分标准：完整，计0分；多重，计1分；软骨下骨血管入侵潮线，计2分。

2.3.4 膝关节软骨MMP-1与MMP-13免疫组织化学染色 膝关节切片脱蜡、复水后进行抗原修复，在4 ℃环境中分别孵育大鼠MMP-1单克隆抗体与MMP-13单克隆抗体16 h；次日使用DAB免疫组织化学试剂盒按说明书操作进行染色后脱水封片。使用Image Pro Plus 6.0软件计算内侧胫骨平台软骨层免疫组织化学染色的平均吸光度(optical density，OD)值以及检测区域面积，以OD值与检测区面积的比值表示MMP-1和MMP-13的表达水平。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量与血清TC、TG、HDL、LDL水平比较 饲喂14周后高脂饮食大鼠的体质量显著高于普通饮食大鼠(

P

<0.05)，经过两周的针灸干预治疗，各治疗组大鼠体质量与模型组相比，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表1。与对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL水平均显著增高(

P

<0.05)，HDL水平显著降低(

P

<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠血清TC、TG水平明显降低(

P

<0.05)，谢氏点穴、温针灸+谢氏点穴治疗组HDL水平显著升高(

P

<0.05)，温针灸+谢氏点穴治疗组LDL水平明显降低(

P

<0.05)；温针灸+谢氏点穴治疗组大鼠血清TC、TG、LDL水平均显著低于温针灸治疗组及谢氏点穴组(

P

<0.05)，HDL水平显著高于温针灸治疗组(

P

<0.05)。见表2。

表1 针灸干预2周后各组大鼠体质量比较

3.2 各组大鼠膝关节病理变化比较 与对照组大鼠相比，高脂饮食诱导的肥胖模型组大鼠膝关节软骨表面粗糙，表层软骨细胞排列紊乱，潮线断裂，有血管通过，软骨层缺失受损并深达骨质钙化负重区。温针灸和谢氏点穴治疗组的软骨表面较完整，软骨细胞排列较紧密，潮线缺失情况较轻，但软骨基质部分有局部缺损；温针灸+谢氏点穴治疗组软骨表面完整，软骨细胞排列紧密，潮线完整，基质完整。见图1。模型组大鼠膝关节Mankin得分显著高于对照组(

P

<0.05)；各治疗组Mankin得分显著低于模型组(

P

<0.05)，且温针灸+谢氏点穴治疗组Mankin得分显著低于温针灸治疗组和谢氏点穴治疗组(

P

<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠血清TC、TG、HDL、LDL水平比较

3.3 各组大鼠膝关节滑液中细胞因子水平比较 与对照组比较，模型组大鼠膝关节滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1、VEGF水平均显著增加(

P

<0.05)。与模型组比较，温针灸治疗组膝关节滑液MCP-1、VEGF水平显著降低(

P

<0.05)，谢氏点穴治疗组TNF-α、MCP-1、VEGF水平均显著降低(

P

<0.05)，温针灸+谢氏点穴治疗组IL-1β、TNF-α、MCP-1、VEGF水平均显著降低(

P

<0.05)；温针灸+谢氏点穴治疗组IL-1β显著低于谢氏点穴治疗组，TNF-α水平显著高于谢氏点穴组(

P

<0.05)，MCP-1水平显著高于温针灸治疗组(

P

<0.05)。见表4。

表3 各组大鼠膝关节Mankin得分比较

3.4 各组大鼠膝关节软骨层中MMP-1、MMP-13表达水平比较 通过免疫组织化学染色观察大鼠膝关节软骨层中MMP-1与MMP-13的表达水平。模型组大鼠膝关节软骨层中出现大量MMP-1、MMP-13阳性细胞，与模型组相比，温针灸点穴治疗组、谢氏点穴治疗组和温针灸+谢氏点穴治疗组的MMP-1、MMP-13阳性细胞数量减少。见图2。平均OD值分析结果表明，模型组大鼠膝关节软骨层中MMP-1、MMP-13表达水平均显著高于对照组(

P

<0.05)；与模型组比较，各治疗组MMP-13表达水平均显著降低(

P

<0.05)，谢氏点穴治疗组、温针灸+谢氏点穴治疗组MMP-1表达水平显著降低(

P

<0.05)；温针灸+谢氏点穴治疗组MMP-1、MMP-13表达水平均显著低于温针灸治疗组和谢氏点穴治疗组(

P

<0.05)。见表5。

表4 各组大鼠关节滑液中细胞因子水平比较

图2 各组大鼠膝关节软骨层中MMP-1、MMP-13阳性细胞表达结果(免疫组织化学染色，10×40倍)

表5 各组大鼠膝关节软骨层中MMP-1、MMP-13表达水平比较

4 讨论

KOA的病因和发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。近年来研究发现，KOA与多种代谢综合征有关，并且肥胖所致的脂质代谢异常是KOA发病的一个重要诱因。Collins等研究发现，长期高脂饮食饲喂能够诱发大鼠的膝骨关节炎症损伤，并且肥胖诱导的KOA与脂肪组织表达的炎症循环因子增加有关。脂质代谢紊乱与慢性炎症已成为肥胖相关KOA的研究热点，但有关针灸对肥胖诱导的KOA作用的报道较少。本研究旨在观察温针灸与谢氏点穴及其联合治疗对肥胖大鼠脂质代谢、膝关节损伤、炎症因子以及关节软骨基质中MMP-1、MMP-13表达的影响，探讨温针灸和谢氏点穴治疗肥胖相关KOA可能的作用机制。

脂质代谢紊乱是诱发KOA的一个重要危险因素，血清TC、TG、LDL增加，HDL减少是肥胖脂质代谢紊乱的主要特点。Triantaphyllidou等发现，HDL缺乏小鼠与正常小鼠相比，更易患KOA，其骨髓中脂肪细胞显著增加，而骨髓脂肪细胞可能通过分泌脂肪因子和炎症细胞因子等参与关节软骨的破坏。de Munter等研究发现，高胆固醇饮食不仅促进小鼠滑膜巨噬细胞的活化，也能促进载脂蛋白在滑膜巨噬细胞中的累积和对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)的摄取，从而激活转化生长因子(transforming growth factor，TGF)超家族的生长因子，导致实验性KOA动物滑膜和骨赘形成增加。脂质代谢紊乱后产生的Ox-LDL能够刺激关节软骨细胞释放VEGF，从而诱导软骨细胞中MMPs、IL-lβ、IL-6和TNF-α的表达。Ox-LDL也可通过激活滑膜中巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生炎症细胞因子和趋化因子(如MCP-1)，从而刺激单核细胞流入，加重膝骨关节炎症反应。因此，脂质代谢紊乱是促进炎症细胞浸润和膝骨关节炎症反应的一个重要诱因。

中医学将KOA归属于“痹证”范畴。痹证是由于气血阻滞、痰瘀聚集所致，而肾肝脾亏虚为痹证之本。饮食不节、嗜食肥甘则损伤脾胃，导致湿热和痰浊内生，痰湿又可导致气滞，而脂积瘀阻，又使气机壅滞，从而形成恶性循环。本研究结果显示，长期饲喂高脂饮食诱导的肥胖大鼠出现脂质代谢紊乱的同时，其膝关节软骨缺失、基质受损严重，关节滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1以及VEGF的分泌增多，并且膝关节软骨中MMP-1和MMP-13的表达也显著增加，具有典型的KOA病理特征，说明肥胖是诱导膝骨关节炎症损伤的一个重要诱因。针灸通过作用病变部位周围穴位，并与循经远端取穴相配合，按照“补其不足”“泻其有余”的治疗原则，诸穴配合，气至病所，以达到行气活血、疏经通络的作用。足三里、三阴交、阳陵泉与承山穴常用于治疗肥胖相关疾病，已被证实可健脾胃、益精气、除湿祛痰，具有减肥调脂的双重作用。在本研究中，温针灸与谢氏点穴均以犊鼻、梁丘、血海三穴为主穴，温针灸辅以足三里与三阴交二穴，谢氏点穴则辅以阳陵泉与承山二穴，以健运脾胃之气。温针灸、谢氏点穴及其联合治疗均可降低肥胖大鼠关节软骨中MMP-1和MMP-13的表达水平以及Mankin得分，但温针灸与谢氏点穴并不能显著减少肥胖大鼠膝关节滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和VEGF的分泌，而温针灸与谢氏点穴联合治疗则能显著降低MCP-1和VEGF的水平，说明温针灸辅以足三里与三阴交，或谢氏点穴辅以阳陵泉与承山虽能抑制软骨细胞MMP-1和MMP-13的表达，但不能有效抑制膝关节的炎症反应，而温针灸与谢氏点穴的联合则能有效抑制膝骨关节炎症反应。

抑制脂质代谢紊乱导致的脂肪异位沉积和Ox-LDL的产生，是肥胖导致膝骨关节炎症损伤的主要原因。在本研究中，温针灸、谢氏点穴及其联合治疗虽然不能降低肥胖大鼠的体质量，但能够显著降低血清中TC与TG的含量，而温针灸与谢氏点穴联合使用不仅显著增加血清HDL的含量，也降低血清LDL的含量，说明在犊鼻、梁丘、血海的基础上辅以足三里、三阴交、阳陵泉与承山能够有效调节肥胖KOA大鼠的脂质代谢。HDL能与胆固醇酯结合形成HDL-C，并逆向转运胆固醇至肝脏，从而减少脂质的异位沉积，而LDL不仅能与胆固醇结合形成LDL-C，促进脂质的肝外转运，也能被氧化成Ox-LDL。因此，笔者认为温针与谢氏点穴的联合能够通过增加HDL、降低LDL加强胆固醇的逆向转运，减少骨关节中脂质沉积和Ox-LDL的产生，从而抑制MCP-1和VEGF的分泌和炎症细胞的浸润，从而缓解肥胖大鼠的KOA症状。

本实验结果显示，温针灸与谢氏点穴能够缓解肥胖大鼠脂质代谢紊乱所致膝关节软骨损伤，减少关节软骨中MMP-1和MMP-13的表达水平。选穴辅以足三里、三阴交、阳陵泉与承山穴可降低肥胖大鼠血清中TC和TG的含量，联合诸穴能够显著改善肥胖大鼠的脂质代谢紊乱状态，通过增加血清中HDL的含量和降低LDL的含量减少脂质异位沉积对软骨细胞的刺激，从而减少关节滑液中VEGF与MCP-1的分泌，抑制肥胖诱导的KOA。