田京歌，冯有龙

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏南京 210019）

泛酸又称遍多酸或维生素B5，是一种水溶性维生素，是辅酶A和酰基载体蛋白生物合成的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪、蛋白质和能量代谢，但游离泛酸对热、酸和碱均不稳定[1-2]，因此工业应用通常使用稳定性好的衍生物——泛酸钙。泛酸钙通常作为一种营养强化剂添加于多种食品和保健食品中，以补充泛酸摄入的缺失，保证人体正常的新陈代谢，保健食品作为一种特殊的食品，越来越引起人们的重视。

测量不确定度可以合理的表征测量结果的范围区间，并关系着合格结论的判定，可以更好地评价测量结果的准确度[3-5]。泛酸钙作为一种重要的营养补充剂，准确测定其含量可以更好地评价保健食品的质量。目前文献报道多是关于食品中泛酸含量测定的不确定度评定[6-7]，未见有保健食品中泛酸钙含量测定的不确定度评定。本文参考《保健食品中泛酸钙的测定》（GB/T 22246—2008）[8]，采用高效液相的方法测定了生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙的含量，为了评价泛酸钙测定结果的准确度，提高检测水平，本试验依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）和 CNAS-CL006：2019 化学分析中不确定度的评估指南程序对不确定度来源进行了分析[9-10]，参考相关文献[11-12]，计算不确定度各分量，并合成结果，以此来评价各个因素对测定结果的影响，进而提高检测水平，控制检测质量，同时为其他相关不确定度评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泛酸钙（批号100370-201903，质量分数96.8%）来源于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Merck公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团有限公司）；磷酸（色谱纯，阿拉丁公司）；水为去离子水（经Milli-Q水处理系统得到）；生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片（江苏省食品药品监督检验研究院提供）。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260，DAD检测器）；超声波清洗器（型号为KH-250DB，昆山禾创超声仪器有限公司）；电子天平（型号CPA224S，赛多利斯）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为ACE 5 Excel 5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH=3.0）-乙腈=95∶5；检测波长为200 nm，流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 µL。

1.3.2 溶液的制备

（1）对照品标准储备液的制备。称量泛酸钙标准品约0.1 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀。

（2）对照品标准使用液的制备。精密量取泛酸钙储备液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（3）标准曲线的制备。吸取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL泛酸钙标准使用液（相当于 2.5 µg、5.0 µg、10.0 µg、20.0 µg、40.0 µg和80.0 µg泛酸钙），分别置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。在给定的仪器条件下，进行色谱分析，以峰面积对浓度作标准曲线。

（4）供试品溶液的制备。称取0.3 g粉碎后的均匀试样（精确到0.001 g），使试样浓度位于标准曲线中。试样置于25 mL容量瓶中，加水20 mL，超声处理20 min后，加水至刻度，摇匀，过0.45 µm滤膜，即得。

1.3.3 数学模型的建立

试样中泛酸钙的含量计算如下：

式中：X-试样中泛酸钙的含量，单位为g/100 g；C-由标准曲线求得进样液中泛酸钙的浓度，单位为µg/mL；V-试样定容体积，单位为mL；m-试样的质量，单位为g。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据检测过程和数学模型分析，泛酸钙含量测定相对标准不确定度ur（X）的来源主要有以下几个方面，具体见图1。其不确定度的来源包括：供试品的称量引入的相对标准不确定度ur（Mt）、供试品的定容体积引入的相对标准不确定度ur（Vt）、供试品的重复测定引入的相对标准不确定度ur（Rp）、方法回收率引入的相对标准不确定度ur（Rc）、供试品溶液的浓度引入的相对标准不确定度ur（C），其中ur（C）来源于对照品储备溶液的制备过程、对照品标准溶液制备过程、标准曲线因素等。

图1 不确定度来源分析图

2.2 不确定度评定

2.2.1 供试品的称量引入的相对标准不确定度u（rMt）

CPA224S型天平为万分之一天平（d=0.1 mg），检定证书的最大允差为±0.000 5，按照矩形分布，k=，称取供试品2份，减重法称重，2次的称样量分别为0.305 1 g，0.302 4 g。则称样量的相对标准不确定度为则供试品称量引入的相对标准不确定度为ur（Mt）=

2.2.2 供试品的定容体积引入的相对不确定度ur（Vt）

本次试验中所用的玻璃仪器的容量允许误差引入的不确定度均按B类不确定度进行评定，容量瓶的体积变化相对液体可以忽略，只考虑液体的膨胀引入的不确定度，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，实验室温度控制在（20±5） ℃，服从矩形分布，则环境温度变化引入的相对标准不确定度为试验采用25 mL的容量瓶，由国家计量检定规程JJG 196—2006[13]查得其容量允差±0.030 mL，则其引入的相对标准不确定度为则

2.2.3 供试品的重复测定引入的相对标准不确定度u（rRp）

在检测过程中，测量重复性引入的不确定度包括了各种随机因素，如人员实验操作熟练程度、仪器性能等，该不确定度属于A类不确定度，平行制备12份供试品溶液，按照“1.3.1”项下的色谱条件进行12次测定，泛酸钙的含量分别为0.297 g/100 g、0.285 g/100 g、0.301 g/100 g、0.308 g/100 g、0.308 g/100 g、0.287 g/100 g、0.298 g/100 g、0.300 g/100 g、0.292 g/100 g、0.302 g/100 g、0.287 g/100 g和 0.291 g/100 g，测得重复测量（n=12）的平均值为=0.296 g/100 g，标准偏差SD（Rp）=0.007 935，则重复测量产生的相对不确定度为

2.2.4 方法回收率引入的相对标准不确定度ur（Rc）

按照低、中、高3种浓度水平（m=3）进行加样回收试验，使待测样品量与加入对照品的量比例分别为1.0∶1.0、1.0∶0.5、1.0∶1.5，每种浓度制备3份供试品，计算方法回收率，结果分别为94.8%、93.7%、95.2%、95.4%、96.5%、93.7%、94.8%、98.2%和92.3%，方法回收率不确定度属于A类不确定度，平均回收率标准偏差SD（Rc）为1.71%，则回收率的相对标准不确定度为采用t检验的方法来分析方法平均回收率与回收率100%之间是否有显著性差异，以此判断是否需要用回收率对计算结果进行修正，而在自由度为8，置信概率为95%下，t0.95（8）=2.31，因t＞2.31，故本试验中需要用回收率来修正计算结果，则供试样品中泛酸钙的实际含量

2.2.5 供试品溶液的浓度引入的相对标准不确定度ur（C）

（1）对照品储备溶液的浓度引入的相对标准不确定度ur（C0）。对照品储备溶液浓度的标准不确定度由对照品纯度和称量等因素引入。泛酸钙对照品由中国食品药品检定研究院提供，说明书中对照品纯度为96.8%，未注明不确定度值，暂假设其纯度为96.8%±0.05%，服从矩形分布（），则对照品纯度引入的相对标准不确定度为

对照品称量引入的不确定度由天平的最大允差计算，采用的为万分之一天平（d=0.1 mg），检定证书的最大允差为±0.000 5，按照矩形分布采用减重法称重，称取对照品量为0.101 6 g，故天平称重引入的相对标准不确定度为

对照品储备液配制过程中使用的是100 mL的容量瓶，其为A级，查得其容量允差为±0.10 mL，按矩形分布，则玻璃器皿引入的相对标准不确定度为因环境温度变化而引入的相对标准不确定度为合成对照品储备液配制过程引入的相对标准不确定度为

将上述不确定度分量合成，得到对照品储备溶液的浓度引入的相对标准不确定度为ur（C0）=

（2）标准溶液的配制过程引入的相对标准不确定度ur（V0）。本试验中由对照品储备液配制对照品工作溶液，之后配制成标曲系列浓度，均会采用玻璃量具，包含刻度吸管、容量瓶等，按照国家计量检定规程的要求，都有相应的允差，按照矩形分布计算，k=，由此来计算所采用的玻璃器皿的相对标准不确定度分量，具体见表1。

表1 玻璃器皿引入的不确定度

则标曲各溶液配制过程中引入的相对标准不确定度为

（3）标准曲线的拟合引入的相对标准不确定度ur（C1）。本试验中系列标准溶液按1.3.1色谱条件分别测定1次，结果见表2。

表2 标曲溶液测定结果

其 中， 斜 率a=13.693 5， 截 距b=1.851 3，则拟合标准曲线峰面积A残差的标准偏差为为测定次数，n=6。

对供试品溶液重复测定12次，p=12，计算得到供试品中泛酸钙的含量为则ur(C1)为：

将以上不确定度分量合成得到ur（C）

2.3 合成不确定度及扩展不确定度

综上分析，本试验中高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量的各相对标准不确定度分量见表3。

表3 相对标准不确定度

将上述不确定度合成得到合成相对标准不确定度为

本试验中测得供试品中泛酸钙的实际含量为Xt=0.312 g/100 g，合成标准不确定度为：

取包含因子为k=2，置信概率为95%，则扩展不确定度为：U=2×Uh(X1) =2×0.004 671=0.0093 g/100 g，因此，HPLC法测定生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量的结果可表示为：（0.312±0.009 3） g/100 g，k=2（95% 的置信区间）。

3 结论与讨论

本文对采用HPLC法测定保健食品多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙的含量进行了不确定度评定，通过计算各个相对标准不确定度，可以推测得出试验中不确定度的来源主要是标曲溶液的配制，其次是样品测定的重复性，方法回收率及对照品储备溶液浓度的影响，最后是标准曲线的拟合及供试品称量及定容体积的影响。因此，在以后的试验测定中要加强对以上影响因素的控制，改进试验方法，尽可能减少试验误差，提高检测数据的质量。

测量不确定度是完整试验数据的一部分，最终得到的扩展不确定度即是测量结果在一定置信水平上的置信区间[14-15]。本试验以多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量测定为例，对测量结果进行了不确定度评定，可以为其他保健食品中功效成分含量测定的评定和相关质量标准的研究提供参考。