极性转换-场放大进样毛细管电泳法分离检测4种兽药样品

2021-02-10孟令辰

宁夏大学学报（自然科学版） 2021年4期

孟令辰, 张翠

(1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，宁夏银川 750004； 2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，宁夏银川 750004)

为促进动物的生长，保护动物的健康，一些药物被加入动物饲料中，但药物的非法添加或滥用会给动物源性食品带来潜在的危险.常见的抗生素、非甾体消炎药、β-兴奋剂的使用，造成肉类及蛋奶制品等动物源性食品中药物残留，导致食用者的健康受到损害，严重者可危及生命[1].因此，为保证食品安全，必须建立针对动物饲料及动物源性食品中兽药成分的快速、高灵敏度检测分析技术[2].目前，针对食品中兽药成分的检测技术以色谱方法为主，包括高效液相色谱法(HPLC)[3]、高效液相色谱-质谱串联分析法(HPLC-MS)[4—7]等，同时也使用酶联免疫分析法(ELISA)等免疫分析技术[8].毛细管电泳法(CE)是近年来新兴的色谱分析技术，因具有分离效率高、分析速度快和样品消耗低的特点，广泛用于食品中兽药成分分析[9—10].而且，CE特有的在线富集技术可进一步提高检测的灵敏度[11—12].但以电动进样为基础的在线富集技术存在一次进样只能分析携带同一种电荷样品的问题.若要分析携带不同电荷的样品，需在分析时使用极性转换技术，即在分析过程中反转电泳仪的正负极，使携带另一种电荷的样品被引入毛细管[13—14].笔者通过极性转换-场放大进样(polarity shift-field enhanced sample injection, PS-FESI)方法，以盐酸克伦特罗、恩诺沙星、磺胺嘧啶及磺胺二甲嘧啶4种兽药为样本，构建高灵敏度检测体系，讨论进样时间、水柱添加与否等对富集效果的影响，并初步验证该方法应用于食品中兽药残留检测的可能性.

1 实验

1.1 试剂与仪器

盐酸克伦特罗(CLE)标准品(w>95%，美国Sigma-Aldrich公司)；恩诺沙星(EN)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)标准品(w>99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)；甲醇(HPLC纯，天津市科密欧化学试剂有限公司).其他试剂均为分析纯，用水为超纯水.

P/ACE MDQ Plus毛细管电泳系统(美国SCIEX公司，配滤光片型紫外检测器)；总长为60 cm、有效长度为50 cm、内径为75 μm的未涂层熔融石英毛细管( 美国Polymicro公司)；FE20 pH计(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司).

1.2 毛细管的活化

将毛细管(50 cm×75 μm，总长为60 cm)依次用甲醇(10 min)、纯水(2 min)、HCl溶液(1.0 mol/L，5 min)、纯水(2 min)、NaOH溶液(1.0 mol/L， 5 min)、纯水(2 min)、PBS缓冲液(10 min)冲洗，冲洗压力均为1.38×105Pa.然后置于PBS缓冲液中，用20 kV电压活化15 min.每日首次实验前，依次用HCl溶液(1.0 mol/L, 2 min)、纯水(2 min)、NaOH溶液(1.0 mol/L, 2 min)、纯水(2 min)、PBS缓冲液(5 min)冲洗，冲洗压力均为1.38×105Pa.冲洗完毕,在PBS缓冲液中用20 kV电压活化5 min，使毛细管保持活化状态.所有溶液均用0.45 μm滤膜过滤器过滤.

1.3 常规气动进样分离检测4种兽药样品

电泳缓冲液为50 mmol/L、pH= 7.8 的磷酸缓冲溶液，分离电压为20 kV，气动进样压力与时间分别为3.45×103Pa，5 s，紫外检测波长为200 nm.在此条件下，对含4种兽药标准品的标准溶液进行检测，绘制标准曲线.

1.4 PS-FESI进样分离检测4种兽药样品

电泳缓冲溶液为50 mmol/L、pH=7.8 的磷酸缓冲溶液，分离电压为20 kV，PS-FESI进样压力与时间分别为-10 kV，30 s，经20 kV分离10 min后再以+10 kV，30 s进样，每次电动进样前以3.45×103Pa的压力引入5 s水柱,紫外检测波长为200 nm.在此条件下，对含4种兽药标准品的标准溶液进行检测，绘制标准曲线.

2 结果与讨论

2.1 常规气动进样

1)进样时间tj及电压Uf对分离结果的影响.tj，Uf对常规气动进样分离结果的影响见图1～图2.

图1 进样时间对峰面积的影响

由图1可知，随着tj的增加，4种兽药样品的峰面积表现出线性增加的趋势.这是因为气动进样属于“非歧视”性进样，样品溶液中的各种样品以相同的速率引入毛细管并进行分离.而引入毛细管的样品越多，后续分离时样品的区带越长，表现出峰面积越大.但随着样品区带的宽度增加，电泳图上各个样品的峰宽也会随着tj的增加而增加，对提高检测灵敏度没有实质贡献.故最终选择tj=5 s.

图2 电压对峰面积的影响

由图2可知，随着Uf的增加，4种兽药样品的峰面积均呈现下降的趋势.这是由于在CE中，样品区带的迁移速度主要随着毛细管内的电渗流变化，而电渗流的速度随着Uf的增加而增加.这样，当引入样品的量即样品区带的长度一定时，Uf的增加使样品区带通过检测窗口的速度提高，从而缩短检测器检测样品区带的有效时间.而Uf过低虽然可以增大样品的峰面积，但也使检测效率大大降低.故综合考虑，选择Uf=20 kV.

2)线性范围、检出最低质量浓度及精密度.将CLE,EN,SD,SM2样品的标准储备液混合、稀释至一定浓度(1～250 μg/mL).在最佳实验条件下检测，以峰面积y对质量浓度x(μg/mL)作图，分别计算得到CLE,EN,SD,SM2的线性方程、相关系数r、线性范围ρ及检测最低质量浓度ρ(LOD).4种兽药样品的电泳图见图3，标准曲线参数见表1.在最佳实验条件下，连续5次对同一工作液进行检测.根据4种兽药样品的y及分离时间计算5次实验的平均相对标准偏差s.4种兽药样品y的s均不大于6.1%，分离时间的s均不大于5.9%.

图3 常规气动进样、最佳条件下4种兽药样品的电泳图

表1 常规气动进样下4种兽药样品标准曲线的相关参数

2.2 PS-FESI进样

1)富集原理.FESI采用的是电动进样方式[15].由于电动进样通过电场力引进样品粒子而非通过压力，不受进样体积的限制，富集因子达1 000.在FESI过程中，毛细管进样端的管口处有较高的场强分布，通过电场力引进的样品粒子,因为场强分布差异而堆积在进样口处，实现富集，即形成场放大进样，且可通过改变进样时间调整样品的富集倍数.

2)极性转换方式的选择.图4为4种兽药样品的化学结构.由图4可知，在纯水及pH= 7.8的PBS缓冲溶液中，CLE以阳离子形态存在，而其他3种以阴离子形态存在.故正向进样电压引入CLE，反向进样电压引入EN，SD，SM2.因此，极性转换进样存在2种选择：先使用正向电压进样，而后转换为反向电压，或先使用反向电压进样，而后转换为正向电压.考虑实验中毛细管内壁未经修饰，故EN，SD，SM2的电泳方向与电渗流方向相反，而CLE的电泳方向与电渗流方向相同.同时，因为电渗流速度远大于电泳速度，先引入阴离子既可以保证较短的分析时间，又可使极性转换时先引入的阴离子不损失.因此，实验选择先使用反向电压引入EN，SD， SM2，分离一段时间后，再转换正向电压引入CLE.

图4 4种兽药样品的化学结构

3)进样时间tj及电压Uj对分离结果的影响.tj,Uj对PS-FESI进样分离结果的影响见图5～图6.由图5～图6可知，随着tj或Uj的增加，4种兽药样品的s均增加.这与常规气动进样过程中tj对分离结果的影响一致.同时，呈阳离子形态存在的CLE峰面积增加幅度大于呈阴离子形态存在的样品.这是因为对于CLE，其电泳方向与毛细管中电渗流的方向一致，在电动进样中能引入更多的样品.对于FESI，水柱的引入虽然能在进样过程中抑制电渗流，但残余电渗流的存在仍会降低EN,SD,SM2的进样量，从而降低其富集效率.同时，水柱的引入还使进样过程中水柱段的热量大幅增加，从而增大后续分离过程中毛细管内产生的气泡使分离电流中断的概率，甚至使毛细管断裂.故对于FESI法，不能通过无限延长tj或提升Uj来提高富集效率.综合考虑，选择10 kV，30 s作为4种兽药样品的进样电压与时间.

图5 进样电压对峰面积的影响

图6 进样时间对峰面积的影响

4)将CLE，EN，SD，SM2样品的标准储备液混合、稀释至一定质量浓度(5.5～200 μg/L)的工作液.在最佳实验条件下，以峰面积y对质量浓度x(μg/L)做图，分别得到CLE，EN，SD，SM2的线性方程、r,ρ,ρ(LOD).4种兽药样品的电泳图见图7，标准曲线结果见表2.在最佳实验条件下，连续5次对同一工作液进行检测，根据4种兽药样品的y及分离时间计算5次实验结果的平均相对标准偏差s.4种兽药样品y的s均不大于6.7%，分离时间的s均不大于6.1%.与文献中数据相比，该方法的检出最低质量浓度相比HPLC法降低了3个数量级[16]，与HPLC-MS法获得的检出限相当[17—18].