王兰兰,张 婷,周 英,关 军,程 平,邹 亮

(武汉市第一医院血液内科,武汉 430022;*通讯作者,E-mail:zouliang0127@163.com)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种以骨痛与病理性骨折、贫血、复发性感染、高钙血症、肾衰竭和异常出血为常见临床表现的恶性肿瘤[1],其特征是单克隆浆细胞在骨髓中不受控制地增殖[2]。凋亡是一种程序化细胞死亡,许多针对血液系统恶性肿瘤凋亡的药物显示出较好的治疗效果[3]。因此,抑制骨髓瘤细胞过度增殖,促进凋亡是一个重要方向。DIS3基因突变被认为是MM发病原因之一[4],但其具体作用机制目前还不清楚。PI3K/AKT/mTOR信号转导通路调节各种生物过程,在细胞增殖、转移和凋亡等过程中发挥重要作用,阻断PI3K/AKT/mTOR通路已成为多种癌细胞治疗新的靶点[5]。研究显示,PI3K/AKT/mTOR与MM之间关系密切[6,7],因此,我们推测DIS3可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路来发挥其作用。在本实验中,我们通过过表达及干扰骨髓瘤细胞中DIS3基因,研究由此所致的细胞凋亡及其潜在作用机制,为临床治疗MM提供些许思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人骨髓瘤细胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清及Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司;真核表达载体PEGFP-N1购自美国Addgen公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH以及山羊抗兔二抗IgG购自美国Abcam公司。

1.2 细胞的复苏、培养及转染

将人骨髓瘤细胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266分别培养于RPMI-1640培养基中(含10% FBS,1%青链霉素溶液),置于37 ℃恒温培养箱中(5% CO2)进行培养。将PEGFP-N1-DIS3及DIS3-siRNA根据Lipofectamine 2000转染说明书对NCI-H929、RPMI 8226和U266细胞进行转染,转染8 h后更换培养基继续培养。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡

将3种细胞均按照以下模式分成5组:对照组(control)、DIS3-siRNA阴性对照(negative control, NC)组、DIS3空载组、DIS3过表达组、DIS3-siRNA组。……